转染荧光效果良好，但是24小时qpcr没有敲低，是要延长收样时间吗？

这是个很实际的问题。在转染实验中，荧光标记良好说明转染效率高，但如果qPCR在24小时没有观察到预期的基因敲低效果，可能存在以下几种情况：

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1. 延长收样时间可能是一个方向

有些siRNA或shRNA介导的敲低效果在48小时甚至72小时后才会明显，因为：

• mRNA的半衰期可能较长；

• 敲低并不等于马上降解已有的mRNA；

• 目标蛋白的表达也可能滞后。

建议：

• 设置一个时间梯度：24h、48h、72h；

• 取样做qPCR和蛋白水平（如果可以，Western blot）检测。

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2. 检查siRNA设计或效率

即使转染效率好，如果siRNA设计不佳，可能不会造成有效敲低。

建议排查：

• siRNA是否对靶点特异；

• 有没有使用阳性对照siRNA（比如针对GAPDH等）；

• 是否有使用多个siRNA序列验证一致性。

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3. 细胞类型与mRNA稳定性

不同细胞系对RNA干扰的反应程度不同，有些细胞本身干扰机制较弱。目标mRNA如果非常稳定，短期内也不容易降解。

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4. 检查qPCR本身是否灵敏可靠

• 引物是否特异、效率是否高；

• 对照组与实验组Ct值是否差异显著；

• 内参基因是否稳定表达。

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实验建议总结：