做嘌呤霉素筛选滴定时，感染两天，puro杀3天，5天细胞长得很密原因和解决方法，另外镜下数整个孔的克隆数感觉困难，能换成镜下视野面积与孔面积比换算吗？

问题1：“感染两天，puro杀3天，5天细胞都长很密”

原因：

细胞分裂快（比如 293T）→ 在5天内即使有筛选，还是会长满。

感染率高 → 很多细胞表达抗性，嘌呤霉素筛选不够“稀释”

建议：

缩短时间：感染 24h 后就加 puromycin，第 2 天开始杀，杀 2–3 天就足够。

更稀释的病毒梯度：推荐加大稀释倍数：1:1000，1:5000，甚至 1:10,000。特别是你的病毒滴度高、marker筛选强的情况。

你的问题2：

“镜下数整个孔的克隆数太难”

确实，整孔成像或肉眼观察细胞簇数是费力又不精准的，尤其克隆多或融合的情况。

替代方案：“视野面积换算法”，完全可行！

操作方式如下：

1.取低倍镜（推荐10×），选 4–6 个随机视野

2.计数每个视野的存活克隆数（可用网格板）

3.求平均克隆数 / 视野

4.查找该放大倍数下单个视野的面积（mm²）

不同显微镜不同，可以问厂家或用刻度尺目测

计算整孔面积（如 24-well 约 2 cm²，6-well 约 9.5 cm²）

最终换算：

全孔克隆数≈平均视野克隆数×(孔面积视野面积)

举例：

假设你用 10× 镜头：

每个视野面积 ≈ 1.0 mm²（可以估算或用载玻片刻度验证）

24-well 孔面积 ≈ 2 cm² = 200 mm²

平均一个视野数到 5 个克隆

则：
估算整孔克隆数=5×(200/1)=1000个

附加技巧：

若克隆难分辨，也可在染色（如 crystal violet）后成像，用 ImageJ 等软件辅助统计。

也可以在低稀释倍数（感染率低）下挑选某个清晰稀疏的孔来统计。

为了提高统计准确性，选 6–10 个视野取平均更靠谱。

总结建议：

问题                                                                         建议
杀选时间太短，细胞太密                 减少感染时间，加大病毒稀释倍数
整孔计数太难                                   镜下随机视野计数 + 面积换算
克隆融合不清晰                               尽早筛选、低 MOI 感染、染色辅助