2022年 8月 20日, 星期六
新闻

DNA 序列测定——双脱氧( Sanger ) 测序法

双脱氧法或酶法利用DNA 聚合酶合成单链DNA 模板的互补拷贝,这一方法最先由F. Sanger 及其合作者发展而来。DNA 聚合酶不能起始DNA 链的合成,而是在复性于“模板“DNA 的引物的3 ‘端上进行链的延伸(图1) 。链的延伸是在引物生长端的3′ 羟基掺入脱氧核糖核苷酸。双脱氧测序法利用了DNA 聚合酶能以2′, 3’-双脱氧核糖核苷酸(ddNTP) 为底物的特性。当ddNTP 被掺入到延伸着的引物的3′ 端时,由于链上3′ 羟基的缺乏,链的延伸就会终止。在4 个测序反应的每个反应中加入4 种可能的ddNTP 中的一种,即可产生4 种不同的反应。调整每个测序反应中的ddNTP 与dNTP的比例,使部分引物延伸链分别终止于每一个在模板DNA 出现该碱基的位置上。这种测序方式,每个延伸反应的产物是一系列长短不一的引物延伸链,它们都具有由复性引物所决定的固定的5’端和终止于某一ddNTP 的不定的3’ 端。

常用的双脱氧测序法有两种常用方案。最早期的双脱氧法,称之为Sanger 法(Sanger et al. 1977, 1980) , 是利用大肠杆菌DNA 聚合酶I 的Klenow 片段而发展起来的 。引物在需要测序的单链DNA 模板的3′ 端进行复性(图1) 。分成4份进行反应,每一份反应中都含有DNA 聚合酶、3 种未标记的dNTP、一种标记的dNTP 及其相应的ddNTP (图1 右侧) 。引物的延伸和标记进行至摄入ddNTP 后被终止。在接下来的反应中,追加高浓度的4 种dNTP 使未被ddNTP 终止的链再延伸

图1 双脱氧测序法。单链DNA 片段与引物复性后进行聚合反应(步骤1) , 在Sanger 法中
(右图), 加人Klenow 酶和放射标记的dATP (步骤2) ,然后,分成4 份进行反应(步骤3),分别加入其余的3 种dNTP 及一种ddNTP (步骤4) 。DNA 的合成进行至摄入ddNTP 后被终止。追加dNTP (步骤5) 使未被终止的链再延伸以产生更高分子质址的DNA。在“标记/终止法”中(左图) ,紧接着步骤1 ,加入限量的4 种dNTP (其中一种为放射性标记)和测序酶(步骤2 ), DNA 的合成至dNTP 耗竭为止。反应混合物等分成4 组(步骤3) ,分别加入4 种dNTP 和一种ddNTP(步骤4 ) ,恢复合成反应,但当掺入ddNTP 后,反应被特异性地终止。在每种方法中,反应终止后,样品加于测序胶的相邻泳道上,进行电泳分离。

以产生更高分子质量的DNA, 这种DNA 链滞留在测序胶的顶部无法分辨。测序产物的平均长度通过ddNTP/dNTP 的比率来控制,比率越高产物越短。

标记/终止法利用修饰的T7 噬菌体DNA 聚合酶得到进一步发展。在两个独立的反应中分别进行引物的标记和双脱氧核苷酸的掺入(图 1 左侧)。复性的引物在4 种低浓度dNTP(其中1 种是放射性标记的)存在时进行延伸。DNA 的合成持续到一种或多种dNTP 被耗竭为止,这样可保证掺入全部的标记的脱氧核糖核苷酸。标记的混合物分到4 个独立的反应中,每个反应除了含有4 种dNTP 外,还各含4 种ddNTP 中的1种。在链终止反应步骤中,高浓度的dNTP 保证DNA 逐次合成至生长链因ddNTP 的掺入而终止。测序产物的平均链长取决于标记反应中dNTP 的浓度(浓度越高产物越长)和终止反应中ddNTP : dNTP 的比例。

当使用测序酶的时,标记/终止法能得到平均长度长于Sanger 法的测序产物。所以这种方法对于从每个模板上获得最大散序列的信息是更有利的。对于测定小片段DNA(如证实结构), Sanger 法通常就足够了。如确定引物后几个核苷酸的序列信息, Sanger 法则更可靠。热稳定的DNA 聚合酶也可以用于双脱氧测序。因为耐热DNA 聚合酶可以在高温下工作,可以用它进行热循环反应,这样可以提高测序产物的产量,因而提高了灵敏度。此外,热稳定聚合酶可以使DNA 模板的二级结构变性,而DNA 的二级结构会干扰延伸进程。

推荐

启动子甲基化调控的miR-148a-3p通过靶向MAP3K9抑制肺腺癌的进展

非小细胞肺癌(NSCLC)占各 …

发表回复

您的电子邮箱地址不会被公开。