2022年 5月 17日, 星期二
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如何制备含血清的培养基?

进行体外哺乳动物的细胞培养,其要点之一是在培养器皿中营造一种生理环境和特殊细胞类型的特异性反应。液态培养基至少要为细胞提供生长所需的营养物质、能量、恒定的pH 和适当的渗透压。此外,培养的外环境,尤其隔水式CO2培养箱,一定要达到稳定的温度和湿度,以防培养液蒸发,还要供给呼吸所需的O2 和维持培养液中碳酸氢盐缓冲系统的CO2 。目前普遍使用的培养基一般由两部分组成:基础营养和补充成分。它们的组成可有相当大的差别。无论怎样,完全培养基的这两组成分都是细胞存活和增殖所不可缺少的。

注意:用于细胞培养的所有溶液和培养液,均应使用反向渗透系统生产的纯净水配制;用后的培养器皿要用水冲洗,不要用消毒剂处理。

注意:所有与活细胞接触的试剂与器械一定要灭菌,同时采用相应的无菌技术。

如何制备含血清的培养基?

许多细胞类型,尤其是成纤维细胞和转化细胞,其生存和增殖都要在基础培养基中添加5%~20% (v/v) 的血清。值得注意的是,如果培养的组织标本中有多种细胞类型,则成纤维细胞占有生长优势。此外,培养基还可有选择性地对抗某些类型细胞的增殖。除了正处于修复的细胞外,添加血清成分的培养基并不真正接近于细胞的生理环境。

材料

  • 基础营养培养基,如DMEM
  • HEPES
  • NaHCO3
  • 谷氨酰胺和丙酮酸
  • 青霉素G 和硫酸链霉素
  • 5mol/L NaOH
  • 血清
  • 除菌滤器
  • 0.2μm 微孔滤器

步骤

  1. 用1.8~0.9 倍体积的水溶解粉末状培养基,不断搅拌。
    •如果是商品化液体培养基,直接加青霉素、链霉素储存液,进入步骤8 。

  2. 加一定量HEPES 溶液,在终体积培养基中为15mmol/L 。

  3. 按生产商推荐剂量添加NaHCO3(例如, 5 % CO2 压力下, NaHCO3 的浓度为14~36mmol/L) 。

  4. 加谷氨酰胺,终浓度为0. 01% (w/ v) ;加丙酮酸,终浓度为0. 01% (w/v) 。

  5. 加青霉素G, 终浓度为100IU/ ml; 加硫酸链霉素,终浓度为50μg/ml 。

  6. 5mol/L NaOH 溶液调节培养基pH 至7. 4, 补足水至终体积(1 X ) 。如果需要,再调整pH 。

  7. 用0. 2μm 微孔滤器过滤培养基, 4°C 避光存放。

  8. 用时按需加入血清。

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