2022年 8月 20日, 星期六
新闻

单克隆抗体制备中的免疫接种

材料
靶抗原: 表达于细胞的抗原,或蛋白质、多肽
生理盐水
无血清培养基:仅用于细胞接种
弗氏完全佐剂(complete Freunds adjuvant, CFA)
实验动物: 无病原体大鼠、小鼠或仓鼠
弗氏不完全佐剂(incomplete Freunds adjuvant, IFA)
1~2ml玻璃注射器(有Luer-Lok 接头,已消毒)
三通管
100ml 烧杯
20G 注射针头,已消毒

1. 将2X 106~5 X 107个细胞或1~50μg 蛋白质或多肤置于生理盐水中制备成抗原。如果免疫原为细胞,在接种前将细胞于无血清培养基中清洗3 次。在融合实验前至少3d 准备好已免疫接种的实验动物(足够用于几次的融合) 。
2. 使用1~2ml 玻璃注射器(有Luer-Lok 接头)吸取抗原,连接三通管。
3. 完全混匀CFA 以打散结核分枝杆菌。用另一支玻璃注射器吸取与抗原液等量的CFA,并连接装有抗原的注射器 。
4. 将抗原液反复注入CFA 再抽出直至稠化混合,制成乳状液。取50ml 冷水置于100ml 烧杯中。挤出一滴乳状液滴于冷水表面以检测乳状液是否稳定。如果乳状液呈液滴状在水面聚集,则进入步骤5 。如果液滴散开则继续混合操作直至稳定的乳状液形成。
5. 将乳状液移入一个注射器,将另一个注射器和三通管移去。将已消毒的20G 注射针头安装于注射器上以封闭乳状液。
6. 麻醉大鼠 ,或固定小鼠或仓鼠 。腹腔内注射乳状液,剂量为:大鼠每只0. 5~1ml 、小鼠每只小于0.2ml 、仓鼠每只0. 2~0. 4ml 。将针头插入皮肤并于皮肤与腹膜壁间穿行一段距离后,再刺入腹膜腔。避免用力压迫注射器的活塞以免过度的压力使针头与注射器分离,造成乳状液的喷溅。在拔出针头前转动针头以减少渗出。
7. 于10~ 14d 后以大约相同剂量的抗原二次免疫动物。如果计划在免疫3d 后进行细胞融合实验,则使用水相溶解的游离抗原或休眠期的完整细胞进行免疫。如果不立刻进行细胞融合,则应用IFA (不含有结核分枝杆菌)乳化的抗原进行免疫,而不使用CFA 。
8 . 如果需要,可以于初次和二次免疫后的7~10d 用ELISA ( 或免疫沉淀法测定抗体滴度)。

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