2022年 1月 28日, 星期五
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siRNA转染答疑专题总结(下)

Q9: 刚开始做实验,准备把RNAi的片段转入染色体内稳定表达,不知道是shRNA还是siRNA哪个比较好而且效率比较高?另外,一个载体里同时放两个针对不同基因的shRNA会不会相互影响?

A9: 稳定转染当然是shRNA。关于一个载体2个shRNA,涉及到2个shRNA的表达和加工的问题,关键还是2个shRNA都需要顺利表达的问题,这就和你的载体,以及2个shRNA在载体的排列有关系。至于蛋白之间的相互影响,应该考虑到了。

Q10: 用慢病毒来包装siRNA来转染细胞,如何确定转染成功的细胞具有稳定性?这种细胞最多能够稳定传代多少代啊?

A10: 我理解你的稳定性是指在子代细胞中也同样出现RNAi效果。瞬时转染的siRNA会在培养传代过程中,不断被降解稀释,以至消失。如果需要在子代中也永久有RNAi,必需将相关siRNA基因整合到细胞基因组中,并表达。一般来说,如果感染并传代2周以后,RNAi效应仍然非常明显,可以初步认定是稳定的。稳定传代的细胞系根据细胞的不同,可以传很多代的。

Q11: NCBI里查到的目的基因有3个mRNA,但是合成siRNA只能选择其中一条mRNA , 目前已有的文献也没有做这个的,该如何选择呢?

A11: 3个mRNA可能至少产生3个蛋白,研究哪个蛋白就选和这个蛋白相关的mRNA,如果不产生蛋白,就根据独立的功能对应的mRNA来研究,如果是研究这个基因的全部功能,就分各个mRNA来分别研究。

Q12: 阴性对照应该是与目的基因的序列无同源性的,那如何评价转染效率?

A12: 带荧光的siRNA,不考虑序列,转染进去细胞内即可出现荧光,故可用于优化转染条件和评估转染效率。而沉默效率则和siRNA序列相关。

Q13: 请问细胞水平实验,选择载体表达的shRNA还是小片段的siRNA?
请问两种在转染效率和沉默时间等有什么区别呢?

A13:根据实验需要沉默的时间来确定是用shRNA还是siRNA,1周以内的短期抑制,采用siRNA较好,无需构建载体,节省时间,还可以采用2次转染的方法,延长RNAi作用的时间到2周。2周以上长效RNAi实验,采用shRNA表达载体较好,效应持续时间长,缺点的需要构建相关载体。效率上,根据具体细胞,实验情况,各有千秋。

Q14: 转染后背景很脏,都是黑点(疑似黑焦虫)在原地运动。做了LB检测,确定该黑点不是细菌,最后发现黑点来源于抽提的质粒,请问有什么办法可以解决吗?

A14: 这种黑点,如果确定不是细菌,多是凝聚的蛋白,还有DNA等的沉淀产物,有人又把它叫“黑胶虫”。人们看到可以动,认为是生物,其实只是布朗运动。这和血清、细胞、转染试剂等都有关系。如果不影响实验,可以通过换液来除去。

Q15: 慢病毒转染多长时间后进行干扰目的基因和蛋白的检测?

A15: 如果用慢病毒进行瞬时表达,一般至少需要24-48小时,慢病毒基因组是RNA,需要反转录成DNA,再生成siRNA,再干扰,才会发生作用。这个过程和细胞类别、细胞活性、慢病毒具体载体等等有关系。建议取不同时间点检测。另外,慢病毒一般都带筛选基因,可以考虑做稳定表达。如果只做瞬时表达,可考虑用转染试剂,成本、时间、方法都要省很多。

Q16: 21nt,22nt,24nt的siRNA如何进行电泳分辨?

A16: PAGE分析,即聚丙烯酰胺凝胶电泳,理论上可以分辨1bp,实际上,在引物的纯化中也常用此种凝胶进行纯化。但由于siRNA很容易降解,尤其在电泳时,需要接触的液体、器皿等都很多,很容易造成在电泳过程中的降解,这样电泳就不易分辨了。如果一定需要分辨,可以采用HPLC或质谱的方法。

Q17: RNAi很容易降解,转染效率很低。EntransterTM产品一般采用什么策略和技术来防范呢?

A17: RNAi中,标准的非修饰的siRNA确实容易降解,这不仅在保存过程中,而且在转染过程中。对siRNA的降解,可以合成修饰的双链siRNA,以提高合成中的稳定性,使用合成好的siRNA,尽量严格做到不要受RNA酶的污染。对转染来说,因为要接触血清,培养基以及细胞内酶的作用。这时,好的转染试剂作用就显现出来了。要做到在血清中游离时,保护siRNA不受培养基中酶和蛋白的降解、吸附等影响,同时在进入细胞后不被溶酶体降解,并能释放到细胞质中。好的转染策略还不仅有保护的作用,更重要的是浓缩siRNA,不将细胞外的其他成分,特别是毒性成分,如抗生素、过多的蛋白带入细胞,以避免细胞产生毒性反应,毒性对RNAi实验来说,影响非常大。

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