2022年 8月 20日, 星期六
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PCR、RT-PCR、qRT-PCR实验精髓

PCR
PCR是很多科研者进入实验室做的第一个分子实验,名字听起来很高级,其实操作起来流程还是比较清晰明了,容易上手。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction),简称PCR,用于放大特定的DNA片段,也可看作生物体外的特殊DNA复制。其中使用的Taq酶是1976年从温泉中的细菌分离出来的。它的特性在于能耐高温,是一个很理想的酶。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制,而后随着Mullis提出新的应用,PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用,Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性–退火–延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板–引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链,重复循环变性–退火–延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

RT-PCR

逆转录-聚合酶链反应大概是我们接触到的第二个PCR技术。原理是:提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于:分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

相对PCR来说,这个实验主要是增加了模板的获取过程。操作SOP按照说明书即可。

这个实验需要的注意事项:

1. 在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂。

2. 为了防止非特异性扩增,需要设阴性对照。

3. 内参的设定:主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、β-Actin(β-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。

4. PCR不能进入平台期,出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定。

5. 防止DNA的污染:①采用DNA酶处理RNA样品;②在可能的情况下,将PCR引物置于基因的不同外显子,以消除基因和mRNA的共线性。

qRT-PCR

实时荧光定量(qRT-PCR)则可能是我们接触的第三个PCR实验。无论是刚进实验室的新手还是已经操作多年的老手,都时不时需要用这个技术来进行基因表达情况测定、转基因的检测、突变体基因的鉴定、组织差异性表达等。对于熟练的师兄师姐,可能带着耳机,在有节奏的枪头吸打声中就做出了完美的曲线。但是大部分第一次做这个实验的人,面对的可能是满屏黄标,而且并不清楚这些值代表什么,为什么会有这样的结果。
实际上,在做qRT-PCR之前,我们第一个需要确定的是内参基因,根据自己实验材料和检测的基因选择好适合的内参基因后。开始为自己的片段设计引物。
与目的基因在内的所有引物Tm值不应相差两度。扩增片段的长度以200-300 bp为宜。除此之外,还需要注意以下法则:1)用于突变体的基因表达量鉴定时,引物最好设在两个外显子之间,横跨中间的内含子,这样可以避免DNA的污染;2)用于过表达基因表达量时,需找出该家族所有同源基因并进行比对,并在保守性最差的区域设计引物;3)用于标记基因检测的引物序列最好来自发表的文献。
最后值得注意的是,引物用完后需放入-20℃保存。尽量避免反复冻融,如果多次使用可在第一次溶解好后进行分装。如果在实验过程中出现以前能扩增的基因扩不出的现象,多半是引物降解或部分降解导致的。在实验期间引物解冻后需用涡旋混匀,离心待用。

最后附一些实用的qRT-PCR体系配置技巧:

1)一定要在冰上配置体系;

2)所有的枪头和PCR板都用进口的,灭菌的;

3)尽量用同一枪头完成样品分装,并且把控每次按压枪的位置标准;

4)模版加在管壁上,避免枪头离开时抽吸液体,最后离心。

肿瘤中激活的T细胞,控制肿瘤生长等,期待这些研究的临床试验数据和应用。

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