2022年 1月 28日, 星期五
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为什么CRISPR没有成为目前基因治疗的首选技术?

CRISPR的热度在分子生物界持续了数年,而2020年的诺贝尔化学奖授予给了两位CRISPR的奠基者,更是将CRISPR的研究热潮推上了顶峰。

CRISPR实际是(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats,成簇的有规律的间隔短回文片段)的简称。 1987年,科学家在大肠杆菌中发现了一段“无法确定功能”的DNA,这段DNA中有一些小片段具有几乎相同碱基排列方式,他们被一些排列方式多变的DNA隔开。当时, 科学家们并没有意识到他们已经探到了原核生物免疫秘密的边缘。

后来,科学家们获取了更多细菌基因组数据后,通过大量比较,鉴定出了位于CRISPR一侧的Cas1-4四种基因。

随着更深入的研究,科学家发现,CRISPR实际上与抵抗外来因子有关,细菌通过Cas蛋白获得免疫。当病毒将自己的DNA注入细菌的时候,Cas识别PAM(protospacer-adjacentmotif, 原间隔序列毗邻基序),接着就将其切割成小段,将前体间隔序列片段整合到CRISPR中,并遗传给自己的后代。若后期或者后代再次遭遇同种DNA入侵的时候,其转录产物便能识别入侵,并借助Cas基因表达的核酸酶清除入侵者的DNA。

利用这个发现,科学家改造CRISPR为基因编辑技术,改装tracrRNA-crRNA,使它与Cas9结合,当他们进入细胞核并识别PAM序列后,会在其后方3个碱基的地方切断DNA,并产生平末端切口。为了将编辑工具顺利转入细胞核,科学家探索出了在载体上插入核定位信号,以及电穿孔和利用病毒整合的方法。因为操作简单,CRISPR/Cas9在几年时间里成为分子生物学技术的热门。

其实在CRISPR之前,早有ZFN、TALEN两种基因编辑技术,而TALEN的特异性最高,是迄今商业化最成功的一项,今天的很多基因治疗项目也是倾向于选择TALEN的。那么,为什么不选择CRISPR呢?

这就需要了解到CRISPR的脱靶效应。

由于sgRNA配对结合区域碱基有限,也许能够配对的DNA片段在基因组里有数个,但如果把sgRNA的定位区设计过长,则有一部分会被剪掉,失去功能。并且在局部不配对的情况下,sgRNA的定位区也有可能与相似的DNA序列结合,导致切割错误的基因。sgRNA(crRNA)在靠近PAM的地方存在一段种子(seed)序列,如果种子序列发生任何错配,就能导致靶点切割效率大跌甚至消失殆尽。基因组越庞大的生物越危险,尤其是拥有31.6亿个碱基的人类。脱靶效应导致的后果,可能是错误的表型,更麻烦的可能是假表型——删除了错误的基因,却与删除目标基因产生了相同的表型。所以sgRNA的设计优化仍是一项长期工作。

今天,CRISPR在小鼠基因敲除上得到了应用,如果从这个方面与体内转染试剂比较,CRISPR依然存在周期长、失败率较高,每只小鼠成本高出几十倍的局限性。

  体内转染 CRISPR
实验周期 最快3天出结果 3个月
目标部位 全身、局部 全身
失败 很少 脱靶现象时有发生
费用 每只小鼠200-600元 每只1-1.5万
转染方式 瞬时 稳定

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