2022年 1月 24日, 星期一
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siRNA表达载体的构建成功要点

  1. 对每个基因设计并检测两到四个siRNA序列

为了找到潜在靶位点,扫描靶基因中的AA序列。记录每个AA 3’端19个核苷酸作为潜在siRNA靶位点。潜在靶位点需通过GENBANK数据库的BLAST分析,去除那些与其它基因明显同源的靶位点。如果可能,siRNA应根据mRNA低二级结构的区域设计。

  1. 选择低GC含量的siRNA
  2. 纯化体外转录siRNA

在转染前要确认siRNA的大小和纯度。

  1. 避免RNA酶污染

微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在,如皮肤,头发,所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品,因此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。

  1. 健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性

通常,健康的细胞转染效率较高。此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验,推荐用50代以下的转染细胞,否则细胞转染效率会随时间明显下降。

  1. 避免适用抗生素

从细胞种植到转染后72小时期间避免使用抗生素。抗生素会在穿透的细胞中积累毒素。有些细胞和转染试剂在siRNA转染时需要无血清的条件。这种情况下,可同时用正常培养基和无血清培养基做对比实验,以得到最佳转染效果。

  1. 选择好的转染试剂转染siRNA

针对靶细胞类型,选择好的转染试剂和优化的操作对siRNA实验的成功至关重要。

  1. 通过合适的阳性对照优化转染和检测条件

对大多数细胞,看家基因是较好的阳性对照。将不同浓度的阳性对照的siRNA转入靶细胞(同样适合实验靶siRNA),转染48小时后统计对照蛋白或mRNA相对于未转染细胞的降低水平。过多的siRNA将导致细胞毒性以至死亡。

  1. 通过阴性对照siRNA排除非特异性影响

合适的阴性对照可通过打乱活性siRNA的核苷酸顺序设计而得。必须注意它要进行同源比较确保相对所要研究的生物的基因组没有同源性。

  1. 通过标记siRNA来优化实验

荧光标记的siRNA能用来分析siRNA稳定性和转染效率。标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验(配合标记抗体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞,将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。

 

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