2022年 1月 28日, 星期五
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siRNA答疑专题总结(上)

Q1:如果慢病毒载体中没有抗性标记,只有GFP,请问还能筛选稳转的细胞传代培养吗?

A1:采用流式分选是流式细胞仪的一个功能,有流式细胞仪就可以了。一般实验室对流式都有专门的人员操作,不需要自己动手。由于没有抗性,需要注意分选过程的无菌操作。

Q2:RNA干扰如果用慢病毒做稳转的细胞株,什么样的目的RNA都可以用来干扰来做稳转的细胞株吗,目的RNA所编码蛋白的作用跟能不能稳转有关系吗,若能稳转,这个筛选的过程大概是多长时间呢?

A2:当然不是任何mRNA都适合建立稳转的细胞株,这里面有两个前提,一是细胞能稳定存活传代,二是某mRNA被稳定的干扰掉。这两个前提必须同时存在才算成功。换句话说,如果某mRNA被干扰会导致细胞不能存活或无法稳定传代,自然无法建立这样的带RNAi的稳定细胞株。

Q3:准备做基因沉默的贴壁原代细胞和另一种正常贴壁细胞TRANSWELL混合培养。混合培养时间最长48小时。是选择siRNA 还是shRNA好?

A3: 由于需要在48小时内产生RNAi,可以选择siRNA,这时最重要的是转染效率足够高。

Q4:准备做癌干细胞RNA干扰前后的细胞生物学行为,是siRNA 还是shRNA 的效率好呢?

A4: 单就siRNA和shRNA干扰效率而言,没有区别;但是你要考虑到转染效率的问题;因为最终的效果=干扰效率*转染效率*各种操作造成的衰减。换种说法,shRNA可以用来筛选,可以保证100%细胞都是KD的,因此positive的结果会更明显。siRNA由于转染效率以及提高转染效率带来的细胞毒性等等会削弱或叠加实验结果,如果你的靶蛋白功能非常强大不可或缺,那么可能会有比较明显的差异;而且siRNA成本很高。shRNA的缺点是,体内很多基因功能互补,那么一个功能非常重要的基因可能有多种互补的途径,经过长期筛选,表型衰减甚至无表型;但成本低廉,而且可以得到稳定的模型。所以互有优劣,但通常首选是shRNA,siRNA多数用于应急或者互补的情况。

Q5: siRNA转染,48h提取RNA,72h提取蛋白,发现RNA水平和蛋白水平都没有沉默效应。不知道哪里出了问题?阳参也没有沉默效果。荧光对照显示转染效率挺高。是检测的时间还需要优化?还是设计的序列有问题?

A5:检测时间问题不大。阳性对照为阴性,说明实验过程或者阳性对照本身就有问题。带荧光标记的转染,需要注意一个问题是:如果带荧光的siRNA只是附着在膜上,而并未进入胞内,在荧光显微镜下看到整个细胞全是荧光,会误认为转染效率很高,一些脂质体转染试剂,如lipo2000,由于是通过膜融合将核酸带入细胞内,往往会有这个问题。

Q6: 慢病毒介导RNA干扰基因的表达,稳转细胞筛选方法?

A6:  RNAi稳转细胞筛选和通常DNA稳转细胞筛选是类似的,如带抗性标志,通过抗性药物筛选。

Q7:最近在做RNAi,是找公司做的质粒载体,一共四个载体,转染后收集细胞提RNA做RT-PCR,但一个都没有起到干扰效果,阳性对照是干扰的GAPDH也没有出现干扰效果,请问怎么办 ?

A7: 如果转染效率没有问题,阳性对照为阴性,说明:1.转染实验和操作没有问题。2.RT-PCR有结果,RT-PCR如果没有被污染,应该过程没有问题。3.质粒载体问题的可能性大。建议:只转阳性对照,进一步确定问题所在。

Q8: 如果我只想筛选干扰的有效序列,有必要做G418稳定细胞系的建立吗?只做瞬转可以吗?

A8: 筛选有效序列,通过westernblot或qRT-PCR即可确定,瞬转siRNA即可。

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