2022年 1月 28日, 星期五
新闻

SDS 碱裂解法制备质粒DNA: 少量制备

该实验方案是从少量( l ~ 2mL ) 细菌培养物中分离质粒DNA 。DNA 产量为l00ng~ 5μg , 这取决于质粒的拷贝数。少量的DNA 作为体外酶促反应的底物或者模板是足够的,但是,如果质粒DNA 用于测序则需要进一步纯化。

很多年以来, 碱裂解法提取质粒DNA 一直是标准的方法。如今,人们更倾向于用试剂盒提取。下列方案是早期实验的回顾。

材料

碱裂解液I<A> ,冰浴

碱裂解液II<A>  破裂解液II 应新鲜制备, 于室温下使用。

碱裂解液III<A> ,冰浴

用于筛选质粒的抗生素

精氨酸缓冲液( 0. lmol/L , pH 12.4 ) (可选;见步骤5 )

配制该溶液,可用p H12.4 的5mol/L NaOH 调整O. lmol/L L-精氨酸溶液的pH 。

转化了所需质粒的细菌克隆

乙醇( 70% , 90%)

酚:氯仿(1:1, VIV) (可选;见步骤8 )

培养基( LB 、YT 或者Terrific Broth ) <A>

STE<A> ,冰浴(可选, 见步骤3 )

Tris-EDTA(TE)(pH 8.0) <A> 含20μg/mL RNase A

设备

细菌摇床, 3 7 °C

KimWipes纸巾

巴斯德吸管和吸球(可选; 见步骤3 )

携带式真空吸气器(可选; 见步骤3 和13 )

方法

细胞的制备

  1. 挑转化后的单克隆菌落,接种到2mL 含有适当抗生素的培养中( LB 、YT 或者Terrific Broth ) ,于37 °C 剧烈振荡过夜。

为确保培养物通气良好:

  • 试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4 倍。
  • 试管盖要盖得松些。
  • 培养物要在剧烈振荡下过夜培养。
  1. 将l.5mL 培养物倒入微量离心管,用微量离心机在4℃ 以最大转速离心30s, 将剩余培养物储存在4℃ 。
  2. 离心完成后, 尽最大可能吸干培养液。

细胞的裂解

  1. 用l00μL 预冷的碱裂解液Ⅰ 重悬细菌沉淀,剧烈振荡。
  2. 加入200μL 新鲜配制的碱裂解液II 于每管细菌悬液中, 盖紧管口,快速颠倒离心管5 次,以混合内容物, 切勿振荡!将离心管放置在冰上。
  1. 加入150μL 用冰预冷的碱裂解液Ⅲ, 盖紧管口,反复数次颠倒,使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解物中分散均匀,之后将管置于冰上3 ~ 5mm 。
  2. 用小离心机于4℃ 以最大转速离心5min,将上清转移至另一离心管中。
  3. ( 可选) 加等量体积的酚:氯仿,振荡混合有机相和水相,然后用小离心机于4℃以最大转速离心2min 。将上清转移至另一离心管中。

质粒DNA 的回收

  1. 用2 倍体积的乙醇于室温沉淀核酸,振荡混合,于室温放置2min 。
  2. 用微量离心机于4 °C 以最大转速离心5mm ,收集沉淀的核酸。
  1. 吸去上清液,将离心管倒置在纸巾上,以使所有的液体排干,用KimWipes 纸巾或一次性吸头除去管壁上的液滴。
  2. 加1 mL 70%的乙醇于沉淀中并将盖紧的试管颠倒数次,用微量离心机在4℃ 以最大转速离心2min, 回收DNA 。
  3. 再次轻微抽吸除去所有上清。
  4. 除去管壁上的乙醇液滴,应将开口的试管置于室温挥发乙醇,直至试管内没有可见液体存在( 5 ~ 10min ) 。
  5. 用50μL 含有去DNA 酶的RNase A (胰RNA 酶) ( 20μg/mL) 的TE ( pH8 . 0 ) 重新溶解核酸,温和振荡几秒,储存于-2 0 °C 。

 

推荐

无菌操作的注意事项及常见问题

做不同的实验,操作上会有小小的 …

发表评论

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注