2022年 8月 17日, 星期三
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DEAE-葡聚糖介导的转染:高效率的转染方法

DEAE -葡聚糖介导的转染与磷酸钙共沉淀介导的转染在三个方面有重要的不同。第一,该方法用于克隆基因的瞬时表达,而不是细胞的稳定转化(Gluzman 1981 ) 。第二,该方法对BSC-1 、CV- 1 和COS 等细胞系非常有效,但对许多其他类型的细胞转染效果不理想。第三, DEAE-葡聚糖转染的DNA 用量比磷酸钙共沉淀转染少。采用0.1 ~ 1.0μg 超螺旋质粒DNA 转染105 个猿猴细胞可达到最高的转染效率,更大量的DNA (大于2~3 μg ) 可能会有抑制效应。磷酸钙介导的转染需要高浓度的DNA 以促进共沉淀的形成,与此相反,DEAE-葡聚糖转染方法很少用到运载DNA 。

试剂

细胞生长培养基(完全培养基和无血清培养基)

二磷酸氯喹 (100mmol/U) <R>

DEAE-葡聚糖( 50mg/mL ) <R>

DEAE-葡聚糖转染试剂盒

指数生长的哺乳动物细胞

磷酸盐缓冲液( PBS ) <A>

质粒DNA

含葡萄糖的Tris 盐缓冲液(TBS -D ) <R>

设备

组织培养皿( 60mm 或35mm )

方法

本方法为生长于60mm 或35mm 培养皿的细胞而设计。如果使用其他多孔板、细胞瓶或不同直径的培养皿,需要按相应比例调整细胞密度和试剂体积

  1. 转染前24h , 通过胰酶消化收集指数生长的细胞,按105细胞/培养皿的密度接种于60mm 组织培养皿(或5 X 104细胞/35mm 培养皿)。加入5mL (35mm 培养皿为3mL ) 完全生长培养基, 于含5 %~ 7% CO2 的37°C 湿润保温箱中培养20 ~ 24h 。
  1. 将0.1 ~ 4μg 超螺旋或环状质粒DNA 与lmg/mL 溶于TBS-D 的DEAE-葡聚糖混合,制备DNA/ DEAE-葡聚糖/TBS -D 溶液。
  2. 吸出细胞培养皿中的培养基,用预热(37℃) PBS 洗涤细胞两次、预热TBS-D 洗涤一次。
  3. 加入DNA/DEAE-葡聚糖/TBS-D 溶液(250μL/60 mm 培养皿, 150μL/35mm 培养皿) 。轻摇培养皿使溶液均匀铺满单层细胞。将细胞放回保温箱培养30 ~ 90min (培养时间取决于各批次细胞对DNA/DEAE-葡聚糖/TBS-D 溶液的敏感程度),每隔15 ~ 20min, 从温箱中取出培养皿,轻轻晃动,在显微镜下检测细胞形态。如果细胞仍然牢固贴附于基质,则继续培养。当细胞开始皱缩变圆时,停止孵育。

 5 . 吸出DNA/DEAE-葡聚糖/TBS-D 溶液,用预热的TBS -D 温和洗涤细胞一次,再用预热的PBS 洗涤一次,注意不要吸走转染的细胞。

  1. 加入5mL (每60mm 培养皿)或3mL (每35mm 培养皿)预热的、含血清和氯喹(终浓度l00μmol/L ) 的培养基,将细胞置于含5% ~ 7% CO2 的37°C 湿润保温箱中培养3 ~ 5h 。
  2. 吸出培养基,用无血清培养基洗涤细胞3 次。向细胞中加入5mL (每60mm 培养皿)或3mL (每35mm 培养皿)含血清培养基,置于含5%~7% C02 的37°C 湿润保温箱中培养36~60h, 然后分析转染DNA 的瞬时表达。
  3. 为分析转染细胞中导入DNA 的瞬时表达情况,在转染后36 ~ 60h 收获细胞。通过杂交分析RNA 或DNA ;通过体内代谢标记进行放射性免疫测定、免疫印迹、免疫沉淀,或者通过检测细胞抽提物的酶活性分析新合成的蛋白质。

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