2022年 8月 17日, 星期三
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DEAE-葡聚糖介导的转染:提高细胞活力的方案

与之前文章中介绍的DEAE-葡聚糖方法相反,此替方案采用较低浓度的DEAE-葡聚糖( 250μg/mL) ,与细胞作用的时间较长(达8h) 。尽管不如使用高浓度DEAE-葡聚糖的转染效率高,但低水平的DEAE-葡聚糖细胞毒性小。

试剂

DMEM 培养基

HEPES 缓冲的DMEM 培养基

方法

  1. 转染前24h, 通过胰酶消化收集指数生长的细胞,按105 个细胞/培养皿的密度接种于60mm 组织培养皿(或5 X 104 个细胞/35mm 培养皿)。加入5mL (35mm 培养皿为3mL )完全培养基,于含5%~ 7%C02 的37°C 湿润保温箱中培养20~ 24h 。
  1. 于lmL HEPES 缓冲的DMEM 中混合O.l ~ lμg 超螺旋或环状质粒DNA 和250μg DEAE-葡聚糖。得到的溶液每60mm 培养皿用量为500μL, 每3 5mm 培养皿用量为2 50μL 。
  2. 吸出细胞培养皿中的培养基,用预热(37°C) 的HEPES 缓冲的DMEM 洗涤细胞两次。
  3. 加入DNA/DEAE-葡聚糖/DMEM 溶液( 500μL/60mm 培养皿, 250μL/35mm 培养皿),将细胞放回保温箱培养8h 。每2h 轻摇培养皿,以保证细胞均匀接触DNA/DEAE-葡聚糖/DMEM 溶液。

同时用二磷酸氯喹处理细胞可使转染效率增加数倍。如果使用氯喹,则应先将其加入DNNDEAE-葡聚糖溶液中(终浓度I00μmo l/L ),然后再将溶液加入细胞中。氯喹对细胞有毒性,此时孵育时间应限制在3 ~ 5h 。

据报道, 对该步骤做一简单变动可使COS 细胞的转染效率加倍(Gonzales and Joly 1995 ) : 在实验开始时用带螺旋盖的小细胞瓶培养细胞,在步骤4 中加入DNNDEAE-葡聚糖/DMEM 溶液后旋紧瓶盖。继续培养8 h , 此期间由于细胞瓶中残留的少量CO2 被代谢掉,培养基缓慢变碱。培养基中酚红指示剂的颜色明显地从绯红逐渐加深至紫红色,这种变化可能会促进转染,与减少保温箱内CO2 浓度的效果类似

5 . 吸出DNA/DEAE-葡聚糖/DMEM 溶液,用预热( 37°C) 的、HEPES 缓冲的DMEM温和洗涤细胞两次。注意不要吸出转染细胞。

6 . 用预热的含血清DMEM (NaHC0 3 缓冲,无HEPES ) 洗涤细胞一次。向细胞中加入5mL (每60mm 培养皿)或3mL (每3 5mm 培养皿)完全培养基, 置于含5%~ 7 % CO2 的37°C 湿润保温箱中培养36 ~ 60h, 然后分析转染DNA 的瞬时表达。

  1. 为分析转染细胞中导入DNA 的瞬时表达情况,在转染后36 ~60h 收获细胞。通过杂交分析RNA 或DNA ; 通过体内代谢标记进行放射性免疫测定、免疫印迹、免疫沉淀,或者通过检测细胞抽提物的酶活性分析新合成的蛋白质。

 

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