2022年 1月 28日, 星期五
新闻

高滴度反转录病毒和慢病毒载体的制备

一、试剂

CaCl2 溶液( 2mol/L )、完全培养基、DMEM 培养基、乙醇(或异丙醇) (70% )、胎牛血清( FBS )、HBS 溶液(2X)、HEPES (2.5mmol/L, pH 7.3)、OptiMEM+ 1 %青霉素/链霉素( P/S )、OptiMEM , 无P/S、pCMVDΔR8.91 质粒、pUMVC 质粒、pVSV- G 质粒、喷雾瓶、293T 细胞、穿梭慢病毒载体质粒、胰蛋白酶EDTA ( 0.05%)

二、设备

小型台式离心机、生物安全柜、漂白剂( 14% )、细胞培养箱( 37 °C )、无菌锥底管( 15mL 和50mL )、培养皿( 150mm )、血细胞计数器、恒湿细胞培养箱(37℃, 5% CO2)、冰和冰桶、带有无菌滤芯(sterile barrier ) 吸头的微量移液器( 20μL 、200μL 和l000μL)、PVDF (聚偏二氛乙烯)、 Durapore 过滤装置( l50mL, 0.45μm 孔径)与真空管、SW32 或SW28 转子、试管架、无菌试管(0.65mL)、SW32 或SW28 转子的超速离心机( Beckman )、一次性超透明圆底管( 25mmX 89mm; Beckman)、UV 光源、涡旋仪

三、方法

转染用293T 细胞平板接种

1 将293T 细胞接种于150mm 平皿的20mL 完全培养基中, 37 °C 、5%CO2恒温细胞培养箱培养,每3 或4 天1 : 10 传代细胞。
2 转染前1 天,弃完全培养基, 用l0 mL PBS 洗涤细胞, 弃PBS 后加入5mL0.05 %胰蛋白酶-EDTA 。室温放置5 ~ l0min ,来回摇动平板直至细胞脱离板底。加入5mL 完全培养基中和胰蛋白酶,然后用力吹打,使胰蛋白酶-EDTA 溶液击打板底,产生单细胞悬液。将细胞悬液转移到50mL 锥底管中。
3 使用血细胞计数器计算悬浮液中细胞浓度。一个150mm 平皿中293T 细胞汇合约为60 X 106~80 X 106个细胞。
4 将21 X 106 个293T 细胞接种于37 °C 预热的150mm 平皿中20mL 完全培养基中。轻轻来回倾斜摇动平皿使细胞均匀分布,然后将平皿置于37 °C 细胞培养箱中过夜。准备5 个平皿。当准备多个平皿时, 计算150mm 平皿所需细胞悬液体积,然后制备终浓度为4.2 X 106个细胞/mL 的细胞悬液。每平皿加入15mL 完全培养基,再加5mL 细胞悬液。如上述均匀地分散细胞。

慢病毒载体和辅助质粒共转染293T 细胞

5 第1 天, 转染前2~ 4h, 将所有平皿的培养基更换为20mL 新鲜完全培养基, 37 °C预热。
6. 准备以下2 个试管,即足够转染5 个150mm 平皿的DNA 。使用带有无菌滤芯的吸头降低污染风险。

i. 管1: 混合DNA (无菌15mL 锥底管中)

慢病毒载体质粒 90μg
pCMVΔR8.91 质粒 90μg
pVSV-G 质粒 60μg

CaCl2 ( 2mol/L )

486μg
HEPES ( 2.5mmol/L) 至总体积为3.9mL

ii.管2: HBS 溶液(无菌5 0mL 锥底管中)

HBS (2x) 3.9mL

7 用70%乙醇彻底喷洒涡旋仪,用纸巾擦拭,将其放入生物安全细胞培养柜中。
8 高速涡旋管2 的同时,在1 ~ 2min 内,逐滴地向管2 中加入管1 的混合液。室温下孵育20 ~ 30min 。
9. 加入1.56mL 步骤8 中的转染溶液至每个150mm 平皿中(步骤5 中制备) 。轻轻来回倾斜摇动平皿使细胞均匀分布,然后将平皿放回37°C 细胞培养箱中孵育过夜。
10. 第2 天早晨,弃培养液,用15mL 、37 °C 预热的DMEM 清洗细胞2 次。尽可能除去洗涤液。

11 将37 °C 预热的含1% P/S 的15mL OptiMEM 加入细胞培养皿中。再将细胞培养皿放回37 °C 细胞培养箱。

收获慢病毒载体上清

12 第4 天上午,将所有培养皿中的培养基转移到2 个50mL 锥底管中,盖紧盖子,并喷洒7 0%乙醇,从生物安全柜中取出。

13. 4 ℃ 、500g 离心50mL 锥底管l0min, 弃细胞。
14 将上清液转移到150mL 、0.45μm 孔径的PVDF 过滤装置中,并与抽真空装置连接。收集病毒滤液(约70mL ) ,冰上放置。
15 此刻,慢病毒载体上清的滴度应为106 ~ 108 个转导单位( TU ) /mL , 这取决于载体和转入基因。如果滴度满足所需,则可分装慢病毒载体上清液并储存于-8 0℃ 。否则立即继续浓缩步骤。

超速离心浓缩漫病毒栽体上清

16 打开SW32 桶,桶置于管架上, 盖内侧朝上,以确保其充分暴露在紫外线下。在生物安全柜中用紫外线照射桶和盖10~ 20min, 或者使用70%乙醇处理桶和盖20 ~ 30min 。风干桶和盖,除去乙醇。
17 . 将2 个25mmX 89mm 超离心管放置架上,加满7 0%乙醇,处理20 ~ 30min 。
18 . 倒出7 0%乙醇。用连接抽真空装置的无菌巴斯德移液管尽可能去除乙醇。用无菌PBS 洗涤离心管2 次。
19 将步骤14 得到的7 0mL 过滤的慢病毒上清平均分配在SW32 桶中,盖紧后从生物安全柜中取出。桶在冰上放置10min 。此外,浓缩慢病毒载体上清的前一天晚上,将SW32(或SW28) 转子4 °C 放置。否则,超速离心机需要相当长的时间使巨大的转子降温。
20 使用SW32 或SW28 转子,离心管在4 °C 下、28000r/min 离心75min 。
21 从转子中取出筒,并将其放置在冰上。70%乙醇喷洒桶,然后转移到生物安全柜中。在生物安全柜中打开筒,用干净的摄子从筒中取出离心管,将上清液倾倒于1 个瓶中,然后加入1/6 体积14%的漂白剂处理lh 后丢弃。在纸巾上倒置超离心管,用连接抽真空装置的无菌巴斯德移液管尽可能吸除管壁上的培养基,避免接触管的圆底。
22 使用200μL 带无菌滤芯吸头的微量移液器,加50 ~ 100μL OptiMEM (无P/S)至每个试管的圆底中心,室温下静置5 ~ 10min 。也可用50 ~ 100μL 的PBS 重悬慢病毒载体。吸头轻轻吹打重悬慢病毒载体病毒颗粒,避免产生气泡。另一种方法是在生物安全柜中将管放置在冰上2h, 然后轻轻吹打。
慢病毒载体颗粒是透明的, 在管底很难辨认。但经小心里悬后, 浓缩的慢病毒载体储备液比OptiMEM 稍微混浊。
23 将慢病毒悬液转移到一个0.65mL 无菌管中并混匀。l0μL 分装,储存于-80 °C 。

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