2022年 8月 17日, 星期三
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转染实验如何设置对照?

所有的转染实验均应包括对照,以检验各个试剂和制备的质粒DNA , 以及检测将要引入的基因或构建体的毒性。

瞬时表达的对照

阴性对照

在瞬时转染实验中,需要用载体DNA 和/或用于稀释待测质粒或基因的缓冲液转染一两个培养皿的细胞。通常采用鲑鱼精DNA 或用于构建重组体的空载体等其他惰性载体代替待测基因转染贴壁细胞。转染后,培养的细胞不应从培养皿上脱落,外观上也不应变圆、变透明。

阳性对照

用编码一种易于检测的基因产物的质粒转染一两个培养皿的细胞,如氯霉素乙酰基转移酶、萤光素酶、大肠杆菌p-半乳糖苷酶或荧光蛋白如绿色荧光蛋白CGFP) 及其衍生物,这些基因的表达由通用启动子驱动,如人巨细胞病毒即早期基因区启动子及相应增强子。这种示踪质粒可从出售含有用于检测编码蛋白的酶和试剂的试剂盒的供应商处获得。由于这些报道基因的内源活性通常很低,酶活性或荧光强度的增加可直接反映转染效率及实验所用试剂的质量情况。在比较不同批次转染实验的结果时,阳性对照尤其重要。将报道基因质粒与待测质粒或基因组DNA 共转染,还可以为转染全程非特异性毒性提供对照。

稳定表达的对照

阴性对照

用鲑鱼精DNA 等惰性核酸代替选择性标记基因转染一两个培养皿的细胞。在适宜的筛选试剂( 如G418 、潮霉素、霉酚酸)存在下培养2 ~ 3 周后,应无细胞集落出现。

阳性对照

用编码选择性标记的空质粒转染一两个培养皿的细胞。筛选2 ~ 3 周后存活的克隆数目可衡量转染/筛选过程的效率。在同时导入选择性标记和待测质粒或基因的细胞培养皿中应出现数量接近的克隆。如果待测培养皿克隆数目与阳性对照培养皿出现明显差异,则可能提示基因产物有毒性( 极少情况下,基因产物可能增强转染细胞的存活力) 。如果证明一种cDNA 或基因对受体细胞有毒性,那么可以考虑采用调控型启动子,如金属硫蛋白启动子( 一种应答于Zn2+或Cd2 的DNA ) 、小鼠乳腺瘤病毒长末端重复启动子( 一种应答于糖皮质激素的DNA) ,或者四环素调控启动子。

注意事项

无论采用何种方法将DNA 导入细胞,瞬时转染或稳定转染的效率很大程度上取决于采用的细胞类型。不同系的培养细胞摄取和表达外源DNA 的能力可相差几个数量级。此外,对一种类型的培养细胞效果很好的方法可能对另一种细胞行不通。

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