2022年 1月 24日, 星期一
新闻

转导细胞的检测分析

1. 制备载体储备液。

2. 以每个靶细胞不同的MOI 或载体剂量转导靶细胞。

腺病毒载体: 100~ 10 000 个病毒颗粒/靶细胞。
腺相关病毒载体: 10 000~ 100 000 个病毒基因组/靶细胞。
慢病毒载体: MOI5 ~ 500 。

3 在转导后3 ~ 5 天对转入基因的表达进行评价。

对于载体编码蛋白质,有多种方法可用来评价转导细胞中转入基因的表达,这取决于转基因的类型、亚细胞定位、可用的抗体或生物检测方法。

·   如果载体编码了荧光标记蛋白,可以使用配有适用滤光器的荧光显微镜来评价
转导。继续下一步。

·   提取总细胞蛋白,通过免疫印迹法或ELISA 定量分析转基因表达。

.使用荧光激活细胞分选术( FACS) 分析转入基因的表达,此方法可定量阳性细胞百分比和转入基因表达强度。

.使用免疫荧光和免疫细胞化学法分析表达及亚细胞定位。

i 为了区别于内源蛋白,或者在免疫沉淀实验中缺乏有效目的蛋白的一抗时,引入了载体编码的蛋白质N 端或者C 端的蛋白质标签(表1) 。此外,含有4 个半胱氨酸的小肽可用于活细胞成像分析蛋白质表达和定位,当二亚砷酸盐化合物存在时,可与带有此标签的蛋白质发生特异结合而发出荧光(Griffin et al.1998) 。

表1  表位标签的氨基酸序列

标签名称

氨基酸序列

HA

YPYDVPDYA

c-MYC

EQKLISEEDL

His6

HHHHHH

FLAG

DYKDDDDK

AUl

DTYRYI

EE (Glu-Glu)

EYMPME

IRS

RYIRS

半胱氨酸短肽

CCPGCCB

GFP

注:在目的蛋白和标签之间加入几个甘氨酸残基是非常重要的。
HA, 血凝素; IRS, 胰岛素受体底物; GFP, 绿色荧光蛋白。
a 此标签使活细胞中特定标记的重组蛋白与二亚砷酸盐化合物共孵育时,发出荧光。注意由Life Technologies 公司商业化的载体中这个标签插入蛋白羧基端时,前后有序列GAGGCCPGCCGGG .

ii. 这些标签对于蛋白质的生物化学和功能的潜在影响值得慎重考虑和分析。另一种方法是将载体转导至不表达特定蛋白质的细胞中,实验从而在空白背景下进行。

iii. 检测培养细胞或体内载体编码蛋白的生物学效应[例如,使用转基因特异性酶学检测、监测离子通道(如囊性纤维化跨膜传导调节因子)转导细胞的电流调节的变化] 。

对于载体编码肪shRNA/miRNA 的检测可使用以下方法。

.提取总细胞蛋白,通过免疫印迹法、ELISA 法、FACS 或免疫染色法对转基因的细胞或空载体对照细胞进行分析。

·   缺乏抗体时,提取总RNA, 应用实时PCR 测定天然细胞和载体转导细胞中靶基因mRNA 水平,持家基因(GAPDH 、β-actin 或18S rRNA) 作为内参。

.靶基因下调的生物学效应。

 

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