2022年 1月 28日, 星期五
新闻

腺病毒实验常见问题

1、腺病毒载体对目的基因的长度是否有要求?

有要求。对E1和E3双缺失的腺病毒载体,比如AdMax的Kit C、Kit D等,其总包装的外源片断要求小于8 kb。而对于只有E1缺失或E3缺失的载体,比如Kit A、Kit B等,外源片断要求小于5 kb。注意,外源片断指包括启动子、外源基因和poly A等在内的整个插入片断。

2、如何提高腺病毒的活性?

提高腺病毒的活性,关键应该是在病毒包装过程和扩增过程。纯化过程只是去掉有缺陷的病毒和细胞碎片等容易引起机体免疫反应的过程,如果扩增的病毒滴度高,那么纯化后就会更高的。

3、克隆到转移载体的基因中的5’和3’UTR(未翻译区)的额外的碱基会影响蛋白表达吗?

UTR尽可能短一些,特别是在5’要避免在mRNA里形成二级结构。在起始密码子ATG前面可以加一小段(6-9bp)的碱基序列可以增强目的基因的表达,比如Kozak序列(GCCGCCACCATG)。

4、如何判断腺病毒载体是否能高效感染某种细胞?

参照文献报道是很简单的办法,也可以用带报告基因的腺病毒先行预实验。

Ad5能高效感染绝大多数人类、小鼠等的体细胞(包括分裂和非分裂细胞),比如肝、肌肉、神经组织等。但对血液系统来源细胞和某些肿瘤细胞,比如乳腺癌、白血病细胞等,感染效率较低。

5、腺病毒载体在体外实验(in vitro)中应注意哪些问题?

1)由于细胞表面受体的差异,腺病毒载体在不同的细胞中转导效率不同。可根据文献报道或用带报告基因的腺病毒载体判断病毒用量。

2)在细胞处于对数生长期时感染病毒效果较好。避免在消化细胞后立刻感染病毒,因为此时细胞膜上的病毒受体往往受到了暂时的破坏。培养过夜后再感染病毒,效果较好。

3)选择适当的转导MOI(病毒感染单位数/细胞数),可以在MOI为 0.1~1000范围内进行试验( 10倍比稀释)。

4)感染病毒时细胞培养液的体积尽量小一些,以完全覆盖细胞为准。如24孔板可用200ul,6孔板1ml。

5)感染时间为90分钟,每15分钟轻轻晃动培养液一次,以混匀。

6)选择适当表达检测时间,一般感染病毒24h后就能检测到目的基因的表达, 48小时表达达到较高水平。

6、用于体内试验的腺病毒,是否要求纯化?

是的,病毒纯化是很必要的。因为细胞裂解液包含有缺损颗粒、大量的腺病毒fiber和penton蛋白(细胞毒素)、培养基、血清以及细胞碎片。这些杂质如果被注入动物体内,会引起宿主强烈的免疫反应。另外,纯化的作用还包括可以将病毒浓缩至一定浓度便于注射、使病毒悬浮于适于体内注射的缓冲液中等。

 

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