碱变性法提取质粒DNA

质粒DNA提取的方法很多，有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、溴化乙锭 – 氯化铯梯度超离心法等。本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法也有多种，但基本原理和步骤是一致的．包括以下步骤：(1)裂解菌体细胞；(2)质粒和染色体DNA的分离；(3)除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分；(4)除去提取过程中使用的去垢剂、盐等。

一、原理

采用碱变性法提取质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

二、步骤

1. 挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。
2. 将5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，取上清液。反复数次，收集全部菌体。
3. 倾去上清，滤纸吸干。
4. 加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L   EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。
5. 加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L   EDTA,0.1mol/L  NaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。
6. 加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3-5 S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染色体DNA。
7. 上清液转移至另一微离心管中，同等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。
8. 上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冰乙醇，14000r/min，离心20分钟。
9. 倾去乙醇，加入70％冷乙醇淋洗。
10. 倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。
11. 加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。
12. 加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。
13. 37℃水浴30min。
14. 样品放-20℃冰箱保存备用。