2022年 8月 17日, 星期三
新闻

石蜡切片制作(苏木精-伊红对染法)详细步骤

1.取材

颈椎脱臼法处死小鼠,打开腹腔,剪取肝组织(或其他组织)。

切取的组织块不宜太大,以利于固定剂穿透,通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织,切成一小块2-3mm厚。

注意事项:

(1)取材动作要迅速,不宜拖太久,以免组织细胞的成分、结构等发生变化。

(2)切片材料应根据需要观察的部位进行选择,尽可能不要损伤所需要的部分。

2.固定

将切好的肝组织用生理盐水洗一下,立即投入中性福尔马林固定液中固定30-50min。

注意事项:

(1)一般固定液,都以新配为好,配好后应贮存在阴凉处,不宜放在日光下,以免引起化学变化,失去固定作用。

(2)有些混合固定液的成分之间会发生氧化还原作用,一定要在使用前混合,如果混合太早,固定时就没有作用了。

(3)固定材料时,固定液必须充足,一般为材料块的20~30倍,有些水分多的材料,中间应更换1-2次新液。

(4)材料固定完毕后,保存于严密紧塞或加盖的容器里,同时在容器外贴上标签,并随同材料在溶液中投入相应的标签,以免混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字,用黑色铅笔写。

3.洗涤

材料经固定后,流水冲洗,数小时或过夜。

4.脱水

材料依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水,各30min,再放入95%、100%各2次,每次20min。

注意事项:

(1)脱水必须在有盖的玻璃品中进行,防止吸收空气中的水分。

(2)在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料以免损坏,可用吸管吸出器皿中的脱水剂,再用吸水吸尽器皿内剩余液,然后于皿中加入高一级脱水剂。

(3)在低浓度酒精中,每级停留不宜太长,否则易使组织变软,助长材料的解体。

(4)在高浓度或纯酒精中,每级停留的时间也不宜太长,否则会使组织变脆,影响切片。

(5)如需过夜,应停留在70%酒精中。

(6)脱水必须彻底,否则不易透明,甚至使透明剂内出现白色混浊现象

5.透明

纯酒精、二甲苯等量混合液15min,二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min(至透明为止)。

由于乙醇与石蜡不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡,所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时,光线可以透过,组织呈现出不同程度的透明状态。

透明注意事项

(1)使用透明剂时,要随时盖紧盖子,以免空气中的水分进入。

(2)更换每级透明剂,动作要迅速,一方面为了不使材料块干涸,另一方面能避免吸收湿气。

(3)在透明过程中, 如果材料周围出现白色雾状,说明材料中的水未被脱净,应退回纯酒精中重新脱水,然后再透明。

6.透蜡

放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min,再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各50-60分钟。

透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等),使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以便包埋。透蜡时间根据组织大小而定。透蜡应在恒温箱内进行,并保持箱内温度在55-60℃左右,注意温度不要过高,以免组织发脆。一般置于恒温箱0.5h。

透蜡注意事项

(1)尽量保持在较低温度中进行,以石蜡不凝固为度;

(2)透蜡温度要恒定,不可忽高忽低;

(3)操作要迅速,尽量在最短的时间内完成石蜡透入过程,以免引起组织变硬、变脆、收缩等。

7.包埋

包埋时,用镊子夹取石蜡模子(金属质地)在酒精灯上稍加热,放在平的桌面上,从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯,倒入少许石蜡。再将镊子在酒精灯上稍加热,夹取材料将切面朝下放入蜡模中,排列整齐。再放上包埋盒,轻轻倒入熔蜡。

8.切片

①将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上。

②将切片刀固定在刀夹上,刀口向上。

③摇动推动螺旋,使石蜡块与刀口贴近,但不可超过刀口。

④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置,刀片与石蜡切片约成15度左右。

⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度,一般为4-10微米。

⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮,让蜡块切成蜡带,左手持毛笔将蜡带提起,摇转速度不可太急,通常以40-50r/min为宜。

⑦切成的蜡带到20-30cm长时,右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起,以免卷曲,并牵引成带,平放在蜡带盒上,靠刀面的一面较光滑,朝下,较皱的一面朝上。

⑧用单面刀片切取蜡片一小段,放在载玻上加水一滴,置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。

⑨切片工作结束后,应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蜡,把切片机擦拭干净妥为保存。

9.展片、贴片

打开水浴锅,使水温维持在40-45℃,另准备30%乙醇溶液。

① 切片时,将一碗30%乙醇溶液放于切片机旁的桌面上。

② 用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带,放在乙醇溶液的水面上,使切片展开。

③小镊子轻轻地将连在一起的切片分开,用一个载玻片将切片完整,已展开的切片捞至温水中,使之充分展开。

④ 另取洁净的载玻片,捞起展开的切片,使其位于切片1/3处,另一端(磨边,粗糙的一端)磨面上标记或贴上标签,放于切片架上。

10.脱蜡复水

    将水浴锅温度调至60℃,待水温控制在60℃时,将切片连同切片架放入一干燥的染色缸内,放入水浴锅中,盖上盖子(可密封),30min至蜡熔化。

之后,石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5min,然后放入100%、95%、90%、80%、70%各级酒精溶液中各3-5min,再放入蒸馏水中3min。

11.染色

切片放入苏木精中染色约10-30min。

染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低,适当缩短或延长。室温高时促进染色,染色时间可短些,否则可适当延长时间,冬季室温低时可放入恒温箱中染色。

12.水洗

用自来水流水冲洗约15min。使切片颜色变蓝(或放入碱性水中也可),但要注意流水不能过大,以防切片脱落。

13.分化

将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色,约2秒至数十秒钟。见切片变红,颜色较浅即可。

14.漂洗

切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。

15.脱水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3-5min。

16.复染

用0.5%伊红乙醇液对比染色1-3min。

伊红主要染细胞质,着色浓淡应与苏木精染细胞核的浓淡相配合,如果细胞核染色较浓,细胞质也应浓染,以获得鲜明的对比。反之,如果细胞核染色较浅,细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染,促使细胞质容易着色,并且经乙醇脱水时不易褪色。

17.脱水Ⅱ

将切片放入95%乙醇中洗去多余的红色,然后放入无水乙醇中3-5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。

18.透明

切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min。

二甲苯应尽量保持无水,应经常更换,或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象,说明脱水未尽,应退回乙醇中重新脱水,否则切片难以镜检。

19.封藏:中性树胶封存

因切片经二甲苯透明,使用中性树胶作为封藏剂,树胶可用二甲苯稀释至合适的稠度。

封藏的方法:

封片前应根据材料的大小,选用不同规格的盖玻片。材料透明后,在桌上放一张洁净的吸水纸,将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上(切片的一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(千万不能待二甲苯干燥后再进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角,然后再缓慢地将盖玻片放下,这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足,可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多,可在干燥以后用刀刮去,并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。

染色结果:细胞核被苏木素染成蓝色,细胞质被伊红染色呈粉红色。

 

 

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