2022年 1月 28日, 星期五
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新生大鼠骨骼肌细胞原代培养及肌管诱导分化

从新生大鼠的骨骼肌中分离成肌细胞(卫星细胞),在体外培养条件下,成肌细胞在培养底物上增殖,在诱导分化条件下,可迁移成直线排列,最终融合形成多细胞肌管。已有报道,将自体的骨骼肌细胞移植入心肌梗死后的瘢痕可改善心
肌功能。这些进展激发了科研人员对体外成肌细胞增殖、分化分子机制的基础研究。下面将介绍新生大鼠骨骼肌细胞的原代培养及肌管诱导分化。该方法也可用于小鼠、兔、猪或狗等动物骨骼肌成肌细胞的培养。

( 一)材料与设备

1. 动物Wistar 新生大鼠(出生24~48h) 。

2. 试剂
(1) MEM-EBSS 培养液,进口优质胎牛血清( FBS), L-谷氨酰胺2mmol/L ,双抗试液(青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml ) ,丙酮酸钠1mmol/L , II 型胶原酶,D-Hanks 溶液, 0.25%胰蛋白酶/0.03%EDTA 消化液,马血清( HS) 。
(2)增殖培养液的配制: MEM-EBSS+15%~20% FBS+双抗试液+L-谷氨酰胺+丙酮酸钠。
(3)分化培养液的配制: MEM-EBSS+2%FBS+10%HS+双抗试液+L-谷氨酰胺+丙酮酸钠。

3. 设备
手术器械,细胞筛(100 目、200 目、400 目),离心机, CO2 培养箱, T25 细胞培养瓶,细胞培养皿(直径60mm), 24 孔板。

( 二) 操作步骤

1. 取24~48h 新生大鼠胸大肌及股四头肌,用眼科剪将其剪成1mm3大小肉糜, 以D-Hanks 溶液冲洗2~3 次。
2. 以0.17%的胰蛋白酶和0.085%的 II 型胶原酶同时消化50~60min, 其间每10min 吹打1 次。
3. 离心(每分钟1000 转,10min) ,弃去上清液, 加入无血清的MEMEBSS培养液在培养皿中用20ml 注射器抽吸、吹打约10 次,以释放骨骼肌卫星细胞。
4 . 分别过100 目、200 目、400 目细胞筛网。
5. 收集细胞悬液于未经包被的培养皿或培养瓶中, 37 °C 静置45 ~60min, 通过差速贴壁法,去除大部分成纤维细胞。
6. 收集未贴壁细胞并计数,以每分钟1500 转的速率离心7min, 弃去上清液。
7. 以含15%~20%FBS 的MEM 增殖培养液重悬细胞, 在24 孔板中,以每孔4x 105~6x 105 个/ml 接种细胞。注意,接种密度可根据实际需求确定,每孔最少不应低于1.5 x I05 个/ml; 接种密度与更换分化培养液的时间有关, 接种密度越高, 更换分化培养液的间隔时间越短,反之亦然。
8 . 细胞贴壁并增殖20~36h (根据接种密度决定),待细胞至60%~70%汇合时,可更换含2 % FBS 和10 %HS 的MEM 分化培养液,之后每24~48h更换1 次分化培养液 。
9. 每孔以1.5x 105 个/ml 的密度接种,可于3~4d 时出现肌管。注意,接种密度可影响肌管形成的时间及形态,接种密度越高,肌管形成越早,肌管数量越多,肌管越粗大。

(三)细胞鉴定

肌丝蛋白免疫细胞化学染色阳性。

(四)小结

组织以酶消化后,轻微机械研磨使肌纤维分离,释放出成肌细胞。不加诱导分化条件,体外可传代4 次。

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