2022年 1月 28日, 星期五
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改良的Boyden 小室法观察细胞的的运动性

该方法常用来检测白细胞和巨噬细胞的趋化性,后经改良用于肿瘤细胞运动性、侵袭性等的测定。Boyden 小室由上、下两个室组成,两室中间由带微孔的滤膜分隔,也可用鸡胚尿囊膜、人胚胎羊膜等分隔。待测细胞放在上室, 其运动性
通过测量滤膜上层到运动最远的细胞之间的距离而确定。也可以计数在滤膜不同平面上细胞数、滤膜底部的细胞数或是另一张在下室的滤膜上细胞数。当上下两室均为生理盐水时, 细胞运动为随机运动。若上下两室中均加以同浓度的化学趋化剂或生长因子等, 可观察到加强的细胞无定向运动。当两室中的化学趋化剂存在梯度时,该方法可观察细胞定向运动。

(一)材料与设备

无血清的NIH/3T3 上清液、Matrigel 胶、Boyden 小室、棉签、甲醇。

(二)操作步骤

1. 制备无血清的NIH/3T3上清   NIH/3T3 细胞达80%汇合时,更换无血清培养液, 继续培养48h。收集上清, -20℃保存(使用时按比例加入20%FBS) 。
2. 包被基底膜   将冻存于-70°C 冰箱的Matrigel 胶4°C 过夜,成液态。用无血清培养液稀释Matrigel (终浓度为1 .2mg/ml ),冰浴混匀。向Boyden 小室的上层小室加入Matrigel 胶70μl ,放入37°C培养箱中,孵育4~5h, 使Matrigel 胶凝固。
3. 细胞接种   用无血清培养液洗Matrigel 胶1 次,轻轻吸去多余液体。用胰蛋白酶消化收集细胞用无血消培养液清洗3 次,含1%FBS 的培养液重悬细胞,调节细胞浓度至2.5×105个/ml。每孔加入200μl 细胞悬液(5×104个/孔),下层小室中加入500μl 无血清NIH/3T3 上清液(另加20%FBS), 37℃ 培养箱中孵育。
4. 结果统计   取出Transwell 用PBS 洗2 次,用棉签擦去基质胶和上室内的细胞, 甲醇固定20min, HE 染色,显微镜下观察,随机选取10 个视野计数。

(三)小结

最早计数运动的细胞是在200 倍光镜下计数移入滤膜不同深度的肿瘤细胞数目。现在常直接计算膜背面的细胞数作为细胞运动的指标。

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