2022年 12月 3日, 星期六
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慢病毒感染细胞常见问题分析

1.用于慢病毒感染的细胞接种量是多少?

根据细胞增殖的速度调整细胞接种量,以保证在感染后4天左右细胞刚好快长满培养皿底部为宜。

针对大部分细胞系:传代周期在2-3天,感染时细胞铺板的密度保持在20-30%左右,则72h后细胞增殖后铺板密度约在90%左右;

针对某些原代细胞: 由于细胞增长缓慢,可以在接种时提高汇合度到50%~60%,但要确保在感染后4天时细胞汇合度达到90%~100%;

针对非分裂细胞: 如神经元细胞,接种后不再增殖,此时可以按照100%的汇合度进行接种。

2.如何确定向细胞中加入慢病毒的最佳时间?

慢病毒感染细胞后需要4天的时间才能观察到慢病毒携带的基因表达,应在细胞汇合度20~40%时且细胞状态良好时加入慢病毒,确保在感染后4天时细胞增长达到90%~100%的汇合度。

3.加入慢病毒病毒后,细胞死亡很厉害,该如何处理?

这种情况是由于慢病毒对该细胞有一定的毒性作用,需要调整并降低感染的MOI值,并且在感染后4小时、8小时、12小时对细胞进行观察,若发现细胞状态变差时,则需要立刻对细胞进行换液操作,使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液。

4.慢病毒感染细胞后什么时候基因表达到达峰值?

慢病毒感染后大部分细胞4天左右GFP或目的基因表达达到峰值,但是对于生长缓慢的细胞,达到峰值的时间会更长。

5.细胞能被慢病毒感染,但为何GFP荧光很弱?

GFP慢病毒感染细胞后,细胞中荧光强度取决于病毒进入到细胞的颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型、观察时间、GFP基因前面的启动子活性等因素。

通常目的细胞感染慢病毒颗粒数越多,细胞本身增殖越快,GFP荧光会较强。慢病毒在增殖较快的细胞中感染96~120小时后,GFP蛋白表达才达到峰值;在增殖较慢的细胞中感染后,GFP蛋白表达达到峰值需要更长的时间。GFP基因接在强启动子后面时荧光表达强;GFP接在弱启动子后面时荧光表达较弱。

6.如何提高慢病毒对细胞的感染效率?

慢病毒对细胞的感染效率受多个因素影响,如细胞自身生长的状态,细胞数量,细胞被慢病毒感染的难易程度等。因此保证细胞正常增殖,轮廓清晰,合适的细胞密度,选择最优的感染条件可以更好的保证感染效率。对于悬浮细胞,可采用离心感染方法,减少病毒感染时的体积,从而提高感染效率。如将细胞培养板密封后,用平角转子离心机1000g离心1h,再放回培养箱中正常培养。

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