2022年 1月 28日, 星期五
新闻

怎样做好荧光原位杂交实验(FISH)?

实验方法及步骤

  1. 探针变性

将探针在75℃恒温水浴中温育5 min,立即置0℃,5~10 min,使双链DNA探针变性。

  1. 标本变性
  • 将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2~3 h。(经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片)。
  • 取出玻片标本,将其浸在70~75℃的体积分数70% 甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2~3 min。
  • 立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水,每次5 min,然后空气干燥。
  1. 杂交

将已变性或预退火的DNA探针10 μL 滴于已变性并脱水的玻片标本上,盖上18×18盖玻片,用Parafilm封片,置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜(约15~17 h)。由于杂交液较少,而且杂交温度较高,持续时间又长,因此为了保持标本的湿润状态,此过程在湿盒中进行。

  1. 洗脱

此步骤有助于除去非特异性结合的探针,从而降低本底。

  • 杂交次日,将标本从37℃温箱中取出,用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
  • 将已杂交的玻片标本放置于已预热42~50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次,每次5 min。
  • 在已预热42~50℃的1×SSC中洗涤3次,每次5 min。
  • 在室温下,将玻片标本于2×SSC中轻洗一下。
  • 取出玻片,自然干燥。
  • 取200 μL复染溶液(PI/antifade或DAPI/antifade染液)滴加在玻片标本上,盖上盖玻片。
  1. 杂交信号的放大(适用于使用生物素标记的探针)
  • 在玻片的杂交部位加150 μL封闭液I,用保鲜膜覆盖,37℃温育20min。
  • 去掉保鲜膜,再加150 μLavidin-FITC于标本上,用保鲜膜覆盖,37℃继续温育40 min。
  • 取出标本,将其放入已预热42~50℃的洗脱液中洗涤3次,每次5 min。
  • 在玻片标本的杂交部位加150 μL封闭液II,覆盖保鲜膜,37℃温育20 min。
  • 去掉保鲜膜,加150 μLantiavidin于标本上,覆盖新的保鲜膜,37℃温育40 min。
  • 取出标本,将其放入已预热42~50℃的新洗脱液中,洗涤3次,每次5 min。
  • 重复前三个步骤,再于2×SSC中室温清洗一下。
  • 取出玻片,自然干燥。
  • 取200 μL PI/antifade染液滴加在玻片标本上,盖上盖玻片。
  1. 封片

可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol(可使封片液产生自封闭作用),为防止盖片与载片之间的溶液挥发,可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20~-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。

  1. 荧光显微镜观察FISH结果

先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野,然后打开荧光激发光源,FITC的激发波长为490 nm。细胞被PI染成红色,而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。

所用不同荧光材料的激发光和发射光波长及滤光镜选择。

 

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