怎样做好荧光原位杂交实验（FISH）？

实验方法及步骤

1. 探针变性

将探针在75℃恒温水浴中温育5 min，立即置0℃，5～10 min，使双链DNA探针变性。

2. 标本变性

• 将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2～3 h。（经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片）。
• 取出玻片标本，将其浸在70～75℃的体积分数70% 甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3 min。
• 立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水，每次5 min，然后空气干燥。

3. 杂交

将已变性或预退火的DNA探针10 μL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37℃杂交过夜（约15～17 h）。由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。

4. 洗脱

此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。

• 杂交次日，将标本从37℃温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
• 将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5 min。
• 在已预热42～50℃的1×SSC中洗涤3次，每次5 min。
• 在室温下，将玻片标本于2×SSC中轻洗一下。
• 取出玻片，自然干燥。
• 取200 μL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

5. 杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针）

• 在玻片的杂交部位加150 μL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37℃温育20min。
• 去掉保鲜膜，再加150 μLavidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖，37℃继续温育40 min。
• 取出标本，将其放入已预热42～50℃的洗脱液中洗涤3次，每次5 min。
• 在玻片标本的杂交部位加150 μL封闭液II，覆盖保鲜膜，37℃温育20 min。
• 去掉保鲜膜，加150 μLantiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37℃温育40 min。
• 取出标本，将其放入已预热42～50℃的新洗脱液中，洗涤3次，每次5 min。
• 重复前三个步骤，再于2×SSC中室温清洗一下。
• 取出玻片，自然干燥。
• 取200 μL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。

6. 封片

可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70℃的冰箱中的暗盒中保持数月之久。

7. 荧光显微镜观察FISH结果

先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源，FITC的激发波长为490 nm。细胞被PI染成红色，而经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。

所用不同荧光材料的激发光和发射光波长及滤光镜选择。