2022年 8月 17日, 星期三
新闻

寡聚(dT)-纤维素柱层析法分离纯化mRNA

【试剂与器材】

(一)试剂

1. 0.1mol/L NaOH ,每组200mL

2. 寡聚Oligo(dT)-纤维素

3. 加样/洗涤缓冲液1:0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组250mL

或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。

4. 洗涤缓冲液2:0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每组250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。

配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,经高压消毒后按各成分确切含量,经混合后再高压消毒,冷却至65℃时,加入经65℃温育(30min)的10%SDS至终浓度。

5. 5 mol/L NaCl,每组10mL

6. 3 mol/L NaAc pH5.2,每组10mL

7. 无RNase双蒸水(DEPC水),每组100mL

8. 70%乙醇,每组10mL

注意:溶液5,6的配制都应该加0.1% DEPC处理过夜,溶液1,3,4,8则用经0.1% DEPC处理过的无RNase双蒸水配制,Tris应选用无RNase的级别。溶液配制后,最好能够按一次实验所需的分量分装成多瓶(如10ml或50ml/瓶)保存,每次实验只用一份,避免多次操作造成对溶液的污染。

(二)器材

1. 恒温水浴箱

2. 冷冻高速离心机

3. 紫外分光光度计

4. 巴斯德吸管

5. 玻璃棉

6. 5ml一次性注射器

【操作方法】

(一) oligo(dT)纤维素的预处理

1. 用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。

2. 将悬浮液装入填有经DEPC水处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床体积为0.5-1.0mL,用3倍柱床体积的无RNase的灭菌双蒸水冲洗oligo(dT)纤维素。

3. 用3-5倍柱床洗涤缓冲液I冲洗oligo(dT)纤维素,直到流出液的pH值小于8.0。

4. 将处理好的oligo(dT)纤维素从巴斯德吸管倒出,用适当的柱床洗涤缓冲液I悬浮,浓度约为0.1g/mL,保存在4℃待用。

(二) 总RNA浓度的调整

1. 把实验一所提的总RNA转到适合的离心管中,如果总RNA的浓度大于0.55mg/mL,则用无RNase的双蒸水稀释至0.55mg/mL,总RNA的浓度对除去rRNA是很重要的。把RNA溶液置于65℃水浴加热5 分钟,然后迅速插在冰上冷却。

2. 加入1/10体积5 mol/L NaCl使RNA溶液中盐的浓度调至0.5 mol/L。

(三) mRNA的分离

1. mRNA与Oligo(dT)-纤维素结合:用移液器重新悬浮oligo(dT)-纤维素,按下表取适量的oligo(dT)-纤维素到RNA样品中,盖上盖子,颠倒数次将oligo(dT)-纤维素与RNA混匀。于37℃水浴保温并温和摇荡15分钟。

总RNA (mg) 

 寡聚Oligo(dT)-纤维素(mL)

 洗涤缓冲液1,2 (mL)

洗脱体积(mL) 

<0.2

 0.2

1.0 

 1.0

 0.2-0.5

 0.5

 1.5

 1.5

 0.5-1.0

 1.0

 3.0

 3.0

 1.0-2.0

 2.0

 5.0

 5.0

2. 转移:取1个5ml的一次性注射器,取适量经过高温灭菌的玻璃棉塞紧前端,并把它固定在无RNase的支架上,再把oligo(dT)-纤维素/RNA悬浮液转移到注射器,推进塞子直至底部,把含有未结合上的RNA液体排到无RNase的离心管中(保留至确定获得足够的mRNA)。

3. 洗涤:根据上表直接用注射器慢慢吸取适量的洗涤缓冲液1,温和振荡,充分重新悬浮mRNA-oligo(dT)-纤维素,推进塞子,用无RNase的离心管收集洗出液。测定每一管的OD260,当洗出液中OD为0时准备洗脱。

4. 洗脱:根据上表直接用注射器慢慢吸取适量(2-3倍柱床体积)的洗脱缓冲液2或无RNase双蒸水到注射器内充分重悬mRNA-oligo(dT)-纤维素,推进塞子以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。

5. 测定每一管的OD260,合并含有RNA的洗脱液组分于4℃,2500g,离心2-3分钟,上清转移至新的离心管中,去掉残余的oligo(dT)-纤维素。

6. 沉淀:洗脱液中加入1/10体积的3mol/L NaAc (pH5.2), 再加入2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀后,-20℃30分钟或放置过夜。

7. 离心收集:12000g, 4℃离心15分钟,小心弃去上清,mRNA沉淀此时往往看不见,用70%乙醇漂洗沉淀,12000g, 4℃离心5 分钟,小心弃去上清液,沉淀空气干燥10分钟,或真空干燥10分钟。将mRNA沉淀溶于适当体积的无RNase的双蒸水,立即用于cDNA合成(或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃)。

8. 定量:测定OD260和OD280,计算产率以及OD260/OD280的比率(同上一实验)。

【注意事项与提示】

1. 整个操作过程必须严格遵守无RNase操作环境规则。

2. 提取的总RNA必须完整,不能被降解,这是mRNA质量的先决条件。

3. 总RNA与Oligo(dT)-纤维素的比例要适当,过量的总RNA,容易造成mRNA不纯。

4. RNA溶液与Oligo(dT)-纤维素结合前必须置于65℃加热5 分钟,这一步很重要,其作用(1)破坏mRNA的二级结构,特别是poly(A+)尾处的二级结构,使poly(A+)尾充分暴露,提高poly(A+)RNA回收率;(2)解离mRNA与rRNA的结合。加热后应立即插入冰上,以免由于温度的缓慢下降使mRNA又恢复其二级结构。

5. 应注意mRNA不能被DNA污染,即使是1 ppm DNA污染,也可严重影响实验结果。

6. mRNA制备后,可用变性琼脂糖凝胶电泳捡测其完整性和有无DNA污染。提取的mRNA应该在0.5~8.0kb之间呈现弥散状,无明显区带,但大部分的mRNA应在1-2.0kb范围内。一般来说,经过一次纯化分离的mRNA还会有微量的rRNA残留,但一般来说不会对后续实验造成很大的影响,如果样品充足,可将经过一次纯化分离的mRNA再纯化一次,进一步提高其纯度。

7. 为防止mRNA降解,应避免多次冻融,可将mRNA少量分装后保存。另外,如果有低温冰箱,最好在 -70℃~ -80℃保存。 也可将mRNA在70%乙醇中-70℃保存一年以上。

8. 寡聚(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净,然后用层析柱加样缓冲液平衡,并加入0.02%叠氮钠(NaN3)冰箱保存,重复使用。每次用前需用NaOH、灭菌 ddH2O、层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。

9. 一般而言,107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA,约相当于上柱总RNA量的1%-2%。

【实验安排】

1. 第一天:试剂的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase处理(0.1%DEPC浸泡或高温干烤)。

2. 第二天:进行(一)、(二)和(三)1-6。

3. 第三天:进行(三)7和变性琼脂糖凝胶电泳捡测mRNA。

4. 为了避免由于保存时间过长造成的RNA降解,最好能将总RNA提取、mRNA的分离纯化、RT-PCR和cDNA文库构建实验安排在连续的时间内进行。

其他:

引物的设计一般遵循的原则:

1)典型的引物20-24个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是太长的引物可能会与错误配对序列杂交降低了特异性,同时因为 比短序列杂交慢,从而降低了产量。

2)设计5’端和中间区为G或C,且GC含量为50%~60%的引物,以增加引物的稳定性及其与目的序列杂交的稳定性。

3)3’末端尽量不要富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。但因为3’端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸,为了避免3’末端的错误配对,所以末端尽量避免为核苷A。

4)在引物对3’末端尽量避免互补序列以免形成引物二聚体,抑制扩增。如果引物序列可能产生内部二级结构会破坏引物退火稳定性,也要尽量避免。

此外,目的序列上并不存在的附加序列,如限制位点和启动子序列,可以加入到引物5’端而不影响特异性。

有时候,仅有有限的序列信息可供用于引物设计。比如,如果仅知道氨基酸序列,可以设计简并引物,同时使用较高的引物浓度(1μM到3μM),因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。

为了增加特异性,可以参考密码子使用表,根据不同生物的碱基使用偏好,减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对,降低引物的退火温度。不要在引物的3’端使用简并碱基,因为3’端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。

 

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