2022年 8月 17日, 星期三
新闻

实时荧光定量PCR实验步骤

1、样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞,室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿,盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后,15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到30℃孵育10分钟后,于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液,每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混匀后,4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时,先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次,使其完全溶解,获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2、RNA质量检测

1)紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释(1:100)后,读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,测定RNA溶液 浓度和纯度。
① 浓度测定
A260下读值为1表示40 µg RNA/ml。样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为:A260 ×稀释倍数× 40 µg/ml。具体计算如下:
RNA溶于40 µl DEPC水中,取5ul,1:100稀释至495µl的TE中,测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl
取5ul用来测量以后,剩余样品RNA为35 µl,剩余RNA总量为:
35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度,比值范围1.8到2.1。
2)变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中,冷却至60℃,10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS电泳缓冲液
浓度       成分
0.4M     MOPS,pH 7.0
0.1M     乙酸钠
0.01M   EDTA
灌制凝胶板,预留加样孔至少可以加入25 µl溶液。胶凝后取下梳子,将凝胶板放入电泳槽内,加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备RNA样品
取3µgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液,加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10µg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h,电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓(其大小决定于用于抽提RNA的物种类型),上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带,RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

3、样品cDNA合成
①反应体系
序号     反应物                   剂量
1         逆转录buffer            2μl
2        上游引物                  0.2μl
3        下游引物                  0.2μl
4        dNTP                       0.1μl
5        逆转录酶MMLV       0.5μl
6        DEPC水                     5μl
7        RNA模版                    2μl
8        总体积                      10μl

轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟,取出后立即冰水浴至管内外温度一致,然后加逆转录酶0.5μl,37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟,得到逆转录终溶液即为cDNA溶液,保存于-80℃待用。

4、梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因(β-actin)实时定量PCR
①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011,反应前取3μl按10倍稀释(加水27μl并充分混匀)为1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104,以备用。
②反应体系如下:
标准品反应体系
序号           反应物               剂量
1       SYBR Green 1 染料     10μl
2      阳性模板上游引物F     0.5μl
3      阳性模板下游引物R    0.5μl
4      dNTP                           0.5μl
5     Taq酶                           1μl
6      阳性模板DNA              5μl
7      ddH2O                          32.5μl
8      总体积                           50μl

轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
管家基因反应体系:
序号             反应物                  剂量
1           SYBR Green 1 染料      10μl
2           内参照上游引物F         0.5μl
3           内参照下游引物R        0.5μl
4           dNTP                           0.5μl
5           Taq酶                           1μl
6           待测样品cDNA             5μl
7           ddH2O                         32.5μl
8           总体积                          50μl

轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机,反应条件为:93℃ 2分钟,然后93℃ 1分钟,55℃ 2分钟,共40个循环。

5、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
①针对每一需要测量的基因,选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
反应体系:
序号             反应物                  剂量
1             10× PCR缓冲液        2.5 ul
2              MgCl2 溶液             1.5 ul
3             上游引物F                0.5 ul
4             下游引物R                0.5 ul
5             dNTP混合液             3 ul
6             Taq聚合酶                1 ul
7             cDNA                       1 ul
8             加水至总体积为        25ul

轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
35个PCR循环(94℃1分钟;55℃1分钟;72℃1分钟); 72ºC延伸5分钟。
②PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010,依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。

6 、待测样品的待测基因实时定量PCR
①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
体系配置如下:
序号          反应物                剂量
1       SYBR Green 1 染料     10 ul
2       上游引物                     1ul
3       下游引物                     1ul
4        dNTP                           1ul
5       Taq聚合酶                   2ul
6        待测样品cDNA            5ul
7       ddH2O                        30ul
8       总体积                        50 ul

轻弹管底将溶液混合,6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为:93℃2分钟预变性,然后按93℃ 1分钟,55℃1分钟,72℃1分钟,共40做个循环,最后72℃7分钟延伸。

7 、实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原则:引物与模板的序列紧密互补;引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构;引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

8 电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳,GoldView™染色,检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。

 

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