2022年 1月 28日, 星期五
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如何制备双链siRNA?

本方案介绍如何将合成的siRNA 有义链和反义链复性形成双链siRNA, 以及利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对双链siRNA 进行分析。

试剂

丙烯酰胺: 双丙烯酰胺(19 : 1, 40%, m/V)
过硫酸铵( 10%, m/V)
复性缓冲液(10 X )
2 脱保护缓冲液[100 mmol/L 乙酸,用四甲基乙二胺( TEMED) 调整pH 至3.8]
DNA 分子质量标准
非变性凝胶上样缓冲液(10X)
无核酸酶水
siRNA
10mg/mL 溴化乙锭
TBE 缓冲液( 5X, 0.5 X)

设备

离心机
加热模块(37 °C, 60 °C, 95°C)
微量离心管(1.5mL)
聚丙烯酰胺凝胶电泳仪
分光光度计
真空离心蒸发浓缩器或者替代品
紫外灯
涡旋振荡仪

方法

1.将siRNA 溶解于无核酸酶水。使用分光光度计测量siRNA 的浓度 。将
RNA 溶液放置冰上以防止RNA 降解。
2.进行以下复性步骤,生成20μmol/L 的双链siRNA 溶液。

有义链siRNA 2nmol
反义链siRNA 2nmol
复性缓冲液(10X) 10μL
无核酸酶水 补足至100μL

3. 95 °C 孵育5mm, 37 °C 孵育2h 。将siRNA 溶液保存于-20°C 或者- 80 °C 。
4. 利用以下试剂制备一块浓度为12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶(如Bio-Rad MiniPROTEAN,8cmX 7.3cmX 0.75mm)

TBE 缓冲液( 5 X )
丙烯酰胺: 双丙烯酰胺( 19: 1, 40%, m/V)
去离子水
1mL
1.5mL
补足至5mL
室温下混匀,而后加入  
过硫酸铁(10%, m/V)
TEMED
50μL
5μL

5. 迅速混匀上述溶液, 然后将其倒入制胶仪中使其聚合。
6. 将双链siRNA 溶解于2μmol/L 的1X 非变性胶上样缓冲液中。
7. 将正义和反义siRNA 分别溶解千4μmol/L 的l X 非变性胶上样缓冲液中。
8. 每个样品上样5μL, 在0.5 X TBE 缓冲液中进行电泳,电压5V 。电泳需要在低电
压条件下进行以避免样品受热变性。
9.电泳结束后,使用溴化乙锭(1 : 20000 溶解于0.5 X TBE 缓冲液中)在室温下染色5min, 在紫外线下观察RNA条带。

配方


复性缓冲液(10 X )

试剂 数量(配制100mL ) 终浓度( 10 X)
乙酸钾( 2mol/L ) 50mL 1mol/L
HEPES-氢氧化钾( KOH ) ( lmol/L, pH7.4 ) 30mL 300mmol/L
乙酸镁( lmol/L) 2mL 20mol/L
补足至100mL  
室温下储存。    

非变性胶上样缓冲液(1 0 X)

试剂数量(配制100mL )终浓度( 10 X)
Ficoll-40015g15% (m/V)
Xylene cyanol FF250mg0 25% (m/ V)
溴酚蓝250mg0 25% (m/V)
补足至100mL 
分装为lmL, -20 ℃ 储存。  

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