2022年 1月 28日, 星期五
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在哺乳动物细胞中通过反义寡核苷酸抑制miRNA 功能

向哺乳动物细胞内转染反义寡核苷酸从而抑制miRNA 功能的具体方法参照本方案。通过检测miRNA 靶蛋白水平或携带miRNA 靶基因的3’端非翻译区( 3UTR ) 报道基因的活性来检测ASO 对于miRNA 的效应。本方案主要针对24 孔板设计,如果用其他多孔板、细胞瓶或不同直径培养皿培养细胞,需根据孔/瓶表面积计算细胞密度和试剂体积

试剂

ASO ( 12.5μmol/L) 和错配和/或无关对照寡核苷酸
转染试剂
DMEM, 不含抗生素和血清
PBS, 不含钙和镁
胎牛血清( FBS) ,热灭活
哺乳动物细胞系(如HeLa 或NTera2)
青霉素和链霉素
胰蛋白酶EDTA 溶液

设备

离心机
锥底离心管(50mL )
免疫荧光和Western 印迹法所用设备(步骤9)
层流生物安全柜(II 级)
体视显微镜
组织培养皿(10cm)
组织培养箱(37℃, 5%CO2) , 一定湿度
组织培养板(24 孔)

方法

准备转染所需细胞

准备转染试剂

所有试验应该包括一个与试验组ASO 侧翼序列一样、长度相同的错配和/或无关对照寡核苷酸。所有体积均表示单一试验孔所需的体积。实验至少需要重复3 次。对于多个孔的转染,需配10% 的富余试剂以弥补混合过程中溶液的损失。
2. 向一个含24μL 无抗生素和血清的DMEM 灭菌试管中加入1μL ( 12.5pmol ) 的实验或对照ASO, 用移液管轻轻吹打混匀。
3 向另一个含24μL 的无抗生素和血清的DMEM 灭菌试管中加入1μL 转染试剂,并轻轻混匀。
4 混合液于室温下孵育5min 。
5 . 将ASO 混合液缓缓地加入转染试剂混合液中。移液管轻轻吹打,混匀,室温下孵育20min 从而形成ASO-脂质复合体。

转染和miRNA 抑制效应分析

6 将步骤Ⅰ 中生长介质换成450μL 无抗生素、含10% FBS 的DMEM, 加热至37 °C 。
7 将50μLASO-脂质转染介质(来自步骤5) 滴入各个孔中。尽量使其覆盖孔中全部细胞,并轻轻摇动。
8 将细胞放入含5% CO2 的37 °C 培养箱培养1 ~ 2 天, 若1 天后观察到细胞毒性,将转染介质换成新鲜的无抗生素、含10% FBS 的DMEM, 继续培养。
9 通过免疫荧光和Western 印迹法检测蛋白质水平,从而分析miRNA 靶基因的表达

疑难解答

问题(步骤8) : 转染miRNA 特异的ASO 和对照ASO 后,细胞均发生死亡。

解决方案: 这可能是转染试剂或者ASO 用量过大引起的; 此外,细胞密度可能太低;
理想状态下细胞融合度应为30% ~ 40% ,每孔约5 X104个细胞。实验前优化转染条件。如果细胞密度太低,需待细胞密度适合时再重复试验。

问题(步骤8) : 仅转染miRNA 特异ASO 时,细胞发生死亡

解决方案: 这一结果表明抑制性miRNA 的靶mRNA 是抗凋亡调节因子。或者, miRNA特异性ASO 可能含一个促进天然免疫反应的序列基序。尽管这些问题可能比较棘手,但尝试一个不同化学组成的ASO (如LNA) 可能有所帮助。

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