2022年 8月 17日, 星期三
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原代细胞的分离培养

原代培养即直接从有机体取下细胞、组织或器官,让它们在体外维持与生长。原代培养的特点是细胞或组织刚离开机体,它们的生物性状尚未发生很大的改变,在一定程度上可反映它们在体内的状态,表现出来源组织或细胞的特性, 因此用于药物实验,尤其是药物对细胞活动、结构、代谢、有无毒性或杀伤作用等,是极好的工具。常用的原代培养法有组织块培养法和消化培养法。

(一)组织块培养法

许多实验室喜欢用组织块培养法进行原代培养,因为方法简单,细胞也较容易生长。尤其是培养心肌,有时还可观察到心肌组织块搏动。细胞从组织块边缘向外长出并铺满培养皿或培养瓶后, 即可进行传代。

1. 设备材料

培养箱、冰箱、超净工作台/无菌间、无菌吸管、离心管、酒精灯、试管架、培养瓶、培养皿、消化液、基础培养液、胎牛血清、Hanks 溶液、双抗试液、剪刀、摄子、小烧杯。

2. 操作步骤

(1) 在无菌条件下,取待培养的组织适量,置入小烧杯中, 以适量Hanks 溶液清洗2~3 次,去掉组织块表面的血污。
(2)用眼科剪将组织块反复剪成0.5~ 1mm3的小块。
(3)再用Hanks 溶液反复漂洗, 直至液体不混浊为止。等组织块下沉,将烧杯倾斜,用小吸管尽量吸除Hanks 溶液。
(4)用含20%灭活血清及双抗溶液(200U/ml 青霉素、200μg/ml 链霉素)的培养液再清洗,用吸管吸干后加入5ml 含20%血清的培养液。
(5)用弯头吸管吸取组织小块,均匀地置于培养皿内表面,吸去多余的培养液,各组织小块之间相距0.5cm 为宜。盖好培养皿盖,做好标记, 置37°C 的CO2培养箱内。
(6) 2~4h 后,于超净工作台中,缓缓地向培养皿中加入上述含20%血清及双抗溶液( 100U/ml 青霉素及100μg/ml 链霉素)的培养液少量,以使组织块浸没在培养液中。
(7)轻轻地将培养皿及组织块移至CO2 培养箱, 如无特殊情况,不必观察。1~2 周后,可观察到细胞从组织块边缘长出,形成生长晕。
(9) 一般说来,若培养液无明显改变, 1 周换液1 次即可。待细胞长满整个培养皿内表面,即可进行传代培养。

3. 需要说明及注意的问题

(1) 如果是用培养瓶而不是培养皿,则接种组织块千培养瓶底壁后, 要轻轻地翻转培养瓶,令瓶底在上,盖好瓶盖后轻轻置入37°C 的CO2 培养箱, 2~4h 后,取出培养瓶,在超净工作台内打开瓶盖,仍令组织块在上方。在组织块对面瓶壁加入适量上述培养液。然后,轻轻翻转培养瓶,让组织块浸没于培养液中。盖好瓶盖后放回二氧化碳孵箱,继续培养。
(2) 从培养皿表面游离下来的组织块,弃去即可。
(3) 如果使用玻璃培养瓶,而不是新的塑料培养瓶,则最好在玻璃底表面包被大鼠鼠尾胶原,这样不但有利于组织块的黏附,而且可使细胞生长得更好。
(4)本方法适于各种组织的培养,操作者还可根据自己的实验需要和细胞种类加以修改。

(二)消化培养法

它与上述组织块培养法的主要区别有2 点。一要用酶制剂(最常用的是胰蛋白酶)处理组织块,除去细胞间质,使细胞相互分离,形成细胞悬液;二细胞生长方式多为单层( monolayer ) 。本方法的优点在于单层细胞更易摄取营养、排出代谢产物,因此生长较快,可较快地应用于实验研究;缺点是步骤颇为繁琐,操作不慎易污染。此外,消化处理要恰到好处,不然对细胞会有一定的损伤作用。

1. 操作程序

(1) 在无菌条件下, 取待培养的组织1cm3左右,置入平皿或烧杯中,以适量Hanks 溶液消洗3 次,去掉组织块表面的血污及结缔组织。
(2)以锋利的眼科剪将组织块反复剪碎,得到约0.5mm x 1mm 大小的小块。
(3)以Hanks 溶液冲洗数遍,稍候组织块下沉,吸除Hanks 溶液。
(4)用少量Hanks 溶液,将组织小块吸入预先置有无菌的磁力搅拌子的锥形烧杯中,再加入15~30ml 上述胰蛋白酶消化液。
(5)将锥形烧杯用橡皮塞盖紧,外封以锡箔。然后移至预先置入37°C 培养箱内的电磁搅拌器上。
(6)打开搅拌器的电源开关,使搅拌子旋转, 关好培养箱,让胰蛋白酶进行消化。
(7)在消化过程中,每隔一定时间吸取消化物滴于载片上,于光学显微镜下观察,检查细胞是否分散成单个。若大部分细胞已分散,立即加入适量Hanks 溶液,终止消化。通常需消化10~20min 。
(8)先以100μm 不锈钢筛过滤,滤去未消化的组织块或大细胞团(如获得的细胞量少,这些组织块可继续进行消化,以便取得较多细胞)。继以20μ 不锈钢筛过滤。
(9)将取得的滤液进行低速(每分钟500~ 1000 转)离心5min,吸除上清液。并用Hanks 溶液离心清洗1~2 次,最后加入含血清的培养液,搅匀,制成细胞悬液。
(10)用计数板计数,确定细胞悬液浓度,通常以1×105~3×105个接种于培养瓶或培养皿中。

2. 需要说明及注意的问题

(1) 用何种酶进行消化可视所培养细胞而定,除胰蛋白酶外,常用1 型胶原酶消化睾丸支持细胞、血管平滑肌细胞和内皮细胞;用II 型胶原酶消化大鼠腺垂体细胞等。
(2)如果没有不锈钢筛, 可用4 层纱布代替,但纱布要预先经高温高压灭菌。
(3) 严格地说,原代培养是指未经传代的细胞,但在实际工作中,人们常将10 代以内的细胞用作原代培养细胞,因为此时的细胞基本上保持着原有的生物学特性。
(4) 从原代培养的操作步骤不难看出,原代细胞中含有多种细胞成分,即它们是异质型( heterogeneity) 的群体,因此在设计实验及分析结果时,切勿忘记这一因素。

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