2022年 1月 28日, 星期五
新闻

动物基因组DNA的提取

实验原理

 在EDTA和SDS等去污剂存在下,用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提,可以得到哺乳动构基因组DNA,用此方法得到的DNA长度为100-150 kb,适用于构建基因组文库和 Southern分析。

通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤,以及相对分子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳技术。

仪器、材料与试剂

(一)仪器

1 . 台式离心机

2 . 玻璃匀浆器

3 . 高压灭菌锅

4 . 恒温水浴锅

(二)材料

1.1.5mL微量离心管

2.微量取样器和吸头

3.无菌过滤器(一次性)

4.10 mL注射器

5.鼠肝

6.三羟甲基氨基甲烷(Tris)

7.十二烷基硫酸钠(SDS)

 8.乙二胺四乙酸(EDTA)

 9.蛋白酶K

10.RNA酶

11.DNA相对分子质量标准物,DNA/EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物

 (三)试剂

1、1.5 mol/L    NaCl

2、0.5 mol/L Tris·HCI    pH8.0

3.0.5 mol/L EDTA    pH8.0

4.3 mol/L NaAc    pH5.2

 以上均高压灭菌。

5.蛋白酶K  10mg/mL配好后用一次性过滤器过滤,-20 ℃ 保存

6 .  组织匀浆液  100mmol/LNaCI,10mmol/LTris·HCl(pH 8.0),0.25mmol/LEDTA(pH8.0)

7.酶解液  200mmol/LNaCI,20mmol/L Tris·HCI(pH 8.O),50mmol/LEDTA(PH 8.0),200~g/mL蛋白酶K,1%SDS

8.无DNA酵的RNA酶 : 将胰RNA酶溶解于10mmol/L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol/L  NaCl溶液中,浓度l0mg/mL,于100℃水浴处理15min,以降解DNA酶,缓慢冷却到室温,-20℃保存

9.TE缓冲液 :10mmol/LTris·HCl(pH8.0),25 mmol/LEDTA(pH8.0)

10.平衡酚(pH8.0):氧仿:异戊醇=25:24:1(体积比)

11.氧仿:异戊醇=24:1(体积比)

12.5xTBE  5.4gTris,2.75g硼酸  2mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0),加水到100mL;

13.6x上样缓冲液  0.25%溴酚蓝,40%(W/V)蔗糖水溶液

14.λDNA/EcoRI+/HindⅢ 相对分于质量标准物片段(bP)21 227,5148,4 973,4 268,3 530,2 027,1 904,1 584,1 315,947,831,564,125

实验步骤

    本实验在无液氮的条件下,制备鼠肝DNA,与有液氮条件下相比,产量和质量都有所下降。整个操作过程中,应尽量避免DNA酶的污染,特别注意动作温和,减少对DNA的机械损伤。

1、取0.2g鼠肝,用冰冷的生理盐水洗3次,然后置于2.0mL匀浆液中,用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在(冰浴操作,切勿将细胞破碎,可镜检观察)。

2、将组织细胞移至1.5ml离心管中,50000rpm离心30-60sec,(尽可能在低温下操作),弃上清,若沉淀中血细胞较多,可再加入细胞体积的一倍匀浆液洗一次。

3、沉淀加0.8mL无菌水迅速吹散,分两管,再加0.4mL酵解液,翻转混匀(动作一定要轻)55℃水浴处理12-18 h;

4、沉淀加RNase至终浓度200µg/mL,37℃水浴1 h;

5、加入等体积酚/氯仿/异戊醇抽提一次,(慢慢旋转混匀,倾斜使两相接触面增大)。4℃、10min、10000rpm离心;

6、有时如果DNA含量过高,水相在下层,实验时应注意观察。用吸头移出含DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀),加等体积氧仿/异戊醇,4℃、10 000rrpm离心10rain (若界面或水相中蛋白含量多,可重复1.6操作)。

7、用吸头小心吸出上层含DNA的水相,加1/10体积的NaAc,小心混匀(要充分),再向每管中加入2.5倍体积的无水乙醇,-20℃  过夜。

8、12 000rpm离心19min,弃上清,75%冷乙醇洗涤一次,12000rpm离心15min室温干燥(不要太干,否则DNA不易溶解),加入适量TE缓冲液,存放于4℃,轻摇溶解过夜,即可得到实验动物基因组DNA。

9、电泳鉴定DNA,由于基因组DNA相对分子质量较大,用0.3%的琼脂糖凝胶电泳鉴定,先在底部铺一层1%的支持胶,凝固后再铺上一层0.3%琼脂糖凝胶,插上梳子(梳子不能碰到支持胶)。取1.5µL溶解的DNA、1µL上样缓冲液和35µl无菌水混匀后小心上样(可在另一孔加DNA相对分于质量标准),观察基因组DNA大小,用溴化乙锭染色观察结果。

[注意事项]

1、操作过程尽量在低温下进行,避免DNA降解。

2、琼脂糖凝胶脆弱,应小心操作。

3、提取得到的基因组DNA应为单一条带,DNA降解可形成弥散带型。

 

推荐

无菌操作的注意事项及常见问题

做不同的实验,操作上会有小小的 …

发表评论

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注