2022年 1月 28日, 星期五
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利用有机溶剂分离纯化高分子质量DNA

分子克隆最基础的操作可能就是核酸纯化了。去除蛋白质的关键步骤经常是简单地利用酚:氯仿和氯仿把DNA 从水相中萃取出来。这种萃取可在进行一步法克隆操作前有效灭活和去除蛋白酶。然而,如果是从复杂分子混合物如细胞裂解液中纯化DNA 时,则需要更多的检测。在这些情况下, 一般是在用有机溶剂萃取前,利用蛋白质水解酶如链霉菌蛋白酶或蛋白酶K (表1 ) 去除大部分蛋白质,而这两种酶对很多种天然蛋白具有活性。

表1 蛋白质水解酶

  母液浓度 储存温度 反应浓度 反应缓冲液 反应温度 预处理
链霉菌蛋白酶a 20mg/mL 溶于水 -20℃ 1mg/mL 0.01mol/L Tris-Cl(PH7.8)
0.01mol/L EDTA
0.5%SDS
37℃ 自消化b
蛋白酶K1 20mg/mL 溶于水 -20℃ 50μ g/mL 0.01mol/L Tris-Cl(PH7.8)
0.005mol/L EDTA
0.5%SDS
37- 56 ℃ 不需要
  • a. 链霉菌蛋白酶是从灰色链霉菌Streptomyces griseus 中分离的丝氨酸及酸性蛋白酶的混合物。
  • b 自消化可去除DNase 和RNase 的污染。自消化的链霖菌蛋白酶可通过将酶粉末溶于10mmol/L Tris-Cl ( pH7.5 ) 、10mmol/LNaCl 至最后使用浓度20mg/mL , 并在37°C 孵育1h 来制备。将自消化的链霉菌蛋白酶小量分装,盖紧盖子于-20℃保存。

利用酚:氯仿萃取

从核酸溶液中去除蛋白质的标准方法是先用酚:氯仿(也可含0.1 %羟基喹啉), 然后再用氯仿抽提。这个操作方法利用了两个不同有机溶剂比一种有机溶剂更能有效去除蛋白质的优点。此外,尽管酚能有效地使蛋白质变性,但不能完全抑制RNase 活性,并且也是具有poly(A)重复RNA 分子的溶剂(Brawe1man et al. 1972 )。所有这些问题可通过使用酚:氯仿:异戊醇( 25 : 24 : 1 ) 避免。随后的氯仿抽提可从制备的核酸中去除所有残留的酚。

之前多年的时间里采用乙醚来达到此目的,但目前常规DNA 纯化已经不需要或不推荐使用。

试剂

氯仿

DNA 样品

乙醇(95%, 70%)

乙醚(可选;见步骤7)

苯酚:氯仿(l : 1, V/V)

盐溶液(10 mol/L 乙酸按, 8mol/L LiCl, 5mol/L NaCl, 或3mol/L 乙酸钠)

TE CpH7.8) <A> (可选;见步骤4)

设备

聚丙烯管

方法

  1. 将样品转移至聚丙烯管中, 加入等体积的苯酚: 氯仿。如果苯酚未平衡到pH7.8 ~ 8.0, DNA 会容易进入有机相。
  2. 混匀管中内容物直到呈现乳状液形式。
  3. 在室温条件下,采用管所能承受的最大转速的80%进行离心混合液。如果有机相和水相未能很好地分开,可再离心较长时间。正常情况下,水相在上层。但水相如果含有盐( >0 .5mol/L) 或蔗糖(>10% ),比重会变大,因此就会在下层。有机相非常容易辨认,因为在平衡过程中加入了8-羟基喹啉而呈现黄色。
  4. 使用移液器将上层水相转移至新鲜管中。如果体积较少(<200μL ) ,使用配有一次性吸头的自动移液器来完成。去除中间相和有机相。为达到最好的回收效率,有机相和中间相可如下再抽提: 在第一次抽提的水相如上转移之后,有机相和中间相中加入等体积的TE ( pH7.8 ) 。充分混匀。按照步骤3 进行离心使不同相分离。将第二次得到的水相与第一次得到的混合继续步骤5 。
  5. 重复步骤1 ~ 4 直到在有机相和水相之间的中间界面中未见可见的蛋白质。
  6. 加入等体积的氯仿,重复步骤2 ~ 4 。
  7. 按照标准流程利用乙醇沉淀法回收核酸。

注意事项

在分离小分子DNA 分子时(<lOkb ) 可用涡旋方法将有机相和水相进行混合。但当分离中DNA 为10 ~ 30kb 时,应轻柔振荡。当分离大分子质量DNA ( >30kb ) 时,需要注意以下事项以避免DNA 被切断。

. 在旋转器上轻柔晃动管( 20r/min ) 使有机相与水相混合。

. 使用大孔的移液器转移DNA 。

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