2022年 8月 17日, 星期三
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冰冻切片法详细步骤

冰冻切片法是组织化学,特别是酶组织化学最常用的切片技术,固定或未固定的组织样品均可进行冰冻切片,新鲜组织冰冻切片对组织细胞内酶类保存最佳,尤其对热、酸、碱、有机溶剂等耐受能力弱的酶和化学物质更加适用。冰冻切片也是免疫细胞化学研究中常用的切片方法,能够较完好地保存多种抗原,尤其是表面抗原的抗原性。

在冰冻切片中,组织中水分易形成冰晶,往往影响酶和抗原的定位。一般认为冰晶少而大时,影响较小;冰晶小而多时,对组织结构损害较大,在含水量较多的组织脏器如脑、心肌、骨骼肌中上述现象更易发生。冰晶形成的主要原因是冷冻速度缓慢,温度偏高,细胞内冷冻不均匀所致,常采取以下措施以减少冰晶的形成。

1. 骤冷    通常采用骤冷、速冻(1~10°C/s 的冷冻速度)的方法可减少冰晶形成。

(1) 干冰-丙酮(乙醇)法。将150~200 ml 丙酮(乙醇)装入小保温杯内,逐渐加入干冰,直至饱和呈黏稠状,再加干冰不再冒泡时,温度可达-70°C ,用一小烧杯(50~100 ml) 装上异戊烧约50 ml, 再将烧杯缓慢置入干冰-丙酮(乙醇)饱和液内,至异戊烧温度达-70°C 时即可使用。将组织块(大小为1 cmX0. 8 cmX0. 5 cm) 投入异戊烧内速冻30~60s 后取出,或置恒冷箱内以备切片,或置-80°C低温冰箱内贮存。

(2) 液氮法。将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内(直径约2 cm) ,如组织块小可适抵加OCT 包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾, 此时小盒保待原位切勿浸入液氮中, 10~20 s 组织即迅速冰结成块。取出组织冰块立即置入-80°C 冰箱贮存备用,或置入恒冷箱切片机冰冻切片。

2. 冷冻保护  加入冷冻保护物质以防止冻害,并在冷冻情况下保持细胞和组织的活性。防止冻害的物质有甘油、二甲亚砜(DMSO) 、蔗糖、甘露糖、聚乙烯吡咯烧酮(PVP) 等。现在,常将组织在冷福尔马林中固定后,贮存于冷胶-庶糖液中。具体步骤如下:

(1) 组织固定于下液, 18~24 h, 0~4°C 。

40 %甲醛                       10 ml
磷酸盐缓冲液(pH7. 2)     50 ml
蔗糖                                7. 5 g
蒸馏水加至                     100 ml

(2) 用蒸馏水稍洗, 0~4°C 。

(3) 移入下液12~24 h, 或更长时间, 0~ 4°C 。

蔗糖                    30 g
阿拉伯胶              1 g
混合,使胶分散,防止加液时结块。再加
蒸馏水                100 ml
麝香草酚             1 粒

蔗糖的最后浓度为0. 88 mol/L, 为高渗溶液,对线粒体有保护作用。经胶-蔗糖液洗后, 冰冻切片,酶反应效果较好。
尽管组织冷冻保护机制尚不清楚,然而,甘油和DMSO 已被用于骤冷过程中防止小块组织生成冰晶。冷冻保护特别适用于超微结构的研究,也适用于光镜和电镜细胞化学研究。冷冻前的预固定也能减少冻害,这对电镜用的超薄切片尤为重要。

3. 恒冷箱冰冻切片  冰冻切片有多种方法,如CO2 制冷冰冻切片、半导体制冷切片以及恒冷箱冰冻切片。恒冷箱冰冻切片机(cryostat) 为较理想的冰冻切片机。

要获得薄的、无人工假象的切片应注意以下几个方面:

a.制备新鲜组织时,骤冷愈快愈好,避免冰晶产生;

b.制备经固定剂固定的组织时,为防止水解酶和其他物质的移位、弥散,常用福尔马林钙液在4℃ 固定18 h 后,进入胶-蔗糖液(4°C) 吸干, 切片骤冷时不必用液氮;

c.防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净;

d.放置组织块时,应视组织的形状及走势来放置;

e.用于贴附切片的载玻片不能存放于冷冻处,于室温存放即可。
切片切出后的处理与制作切片时的操作同样重要。

在这一方面,不同的学者提出了许多不同的方法,所有的方法皆有长处和不足之处。可归纳为以下几种:
(1) 将切片贴在温(室温)或冷(恒冷箱切片机温度)的载玻片或盖玻片上。当融化时浸于固定剂固定,或浸于冷的“保护剂”中。
(2) 将切片贴于温或冷的载玻片或盖玻片上,融化,并在空气中干燥。
(3 将切片贴于温或冷的载玻片或盖玻片上,融化、干燥后固定。
(4) 将切片贴在非玻璃物质上(如乙酸纤维素膜、半透膜等) 。
(5) 移入温或冷的试液中(特别是蛋白质或无机物的组织化学)。
(6) 移入温或冷的固定剂中。
(7) 冷冻干燥。
(8) 冷冻替代。

对于大多数实验可先用前3 种方法。对不稳定的酶组织化学, (2) 或(5)法为宜。假如所研究的酶能经受固定作用,则可用(1)、( 3) 或( 7) 法。如果是可溶的酶,可在孵育液中加入固定剂(同时固定)或应用半透膜技术。把新鲜冰冻切片冰冻干燥,一般只用于定量组织化学中。应当知道,上述方法都有缺点,方法的选择应根据实际情况,而不应仅从理论上的考虑来决定。

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