2022年 1月 28日, 星期五
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什么是反向PCR?

1、原理

反向PCR(reverse PCR)是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段,而常规PCR扩增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶切,然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接,再用一对反向的引物进行PCR,其扩增产物将含有两引物外未知序列,从而对未知序进行分析研究. 

2、目的及应用

反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA,也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列,因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补,但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA,然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子,通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段;现已制备了酵母人工染色体(YAC)大的线状DNA片段的杂交探针,这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。

PCR只能扩增两端序列已知的基因片段,反向PCR可扩增中间一段已知序列,而两端序列未知的基因片段不扩增。

反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA,也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列,因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补,但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA,然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子,通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段;现已制备了酵母人工染色体(YAC)大的线状DNA片段的杂交探针,这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。

3、不足

该方法的不足是:①需要从许多酶中选择限制酶,或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。

②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列,而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列,这样,通过反向PCR得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。

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