2022年 8月 17日, 星期三
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人脐静脉内皮细胞的培养

体外培养的血管内皮细胞已广泛应用于血管疾病、血管修复、肿瘤血管形成等基础研究及临床研究中。体外培养的血管内皮细胞,仍可保持血管内皮细胞的特征,如表达VIII因子、怀布尔-帕拉德小体(Weibel-Palade body ) 、内皮细胞特异性抗原和IV 型胶原等,还可在三维培养体系或特定诱导条件下形成血管样结构。体外培养的血管内皮细胞生长形成单层后,会表现出接触抑制和密度限制,将停止生长。人们已成功培养了牛主动脉内皮、人脐静脉内皮、脑微血管、肺微血管、肝窦微血管及各种肿瘤组织中的血管内皮细胞。下面要介绍最常用的人脐静脉血管内皮细胞的培养。

(一)材料与设备

1. 设备  超净工作台、离心机、水浴锅、CO2 培养箱、-10℃ 冰箱、-20℃冰箱。
2. 无菌材料  大培养皿、止血钳、静脉插管、500ml 大烧杯、消毒的蒸馏水、50ml 离心管、刻度吸管、弯头吸管、T25 培养瓶、广口试剂瓶、脐带(1根)、保鲜液(0.01% EDTA/DMEM, 4℃储藏)、高糖DMEM 培养液、胎牛血清、青/链霉素、D-Hanks 溶液、I 型胶原酶、VEGF 或ECGS 。

(二)操作步骤

1. 产科无菌取脐带1 根, 置于含保鲜液的广口试剂瓶中4℃保存(避免污染),在最短的时间内,将脐带携入实验室,进行以下操作。
2. 在超净工作台或无菌层流工作台上,将脐带用D-Hank 溶液清洗干净,将静脉插管插入脐静脉中,并用丝线结扎、固定。
3. 用20ml 注射器将37℃ 的D-Hanks 溶液注入脐静脉,反复冲洗至清洗液无色澄清为止。
4. 用血管钳夹住脐静脉的另一端,并将0.2%的Ⅰ型或Ⅱ 型胶原酶(约20ml) 通过静脉插管注入脐静脉中, 至脐静脉完全充盈为止(排掉静脉管中的空气)。
5. 将脐带放置在盛有37℃水的玻璃烧杯中,在37°C 水浴条件下消化约20min(每5min 抽吸/注入1 次)。
6. 当酶液变成混浊时(在显微镜下可见大量游离细胞),将酶液在脐静脉中反复抽吸冲打3 次后,吸出并置于50ml 离心管中。
7. 细胞悬液经350g 离心5min 后,弃去上清液,并用D-Hanks 溶液清洗2次,然后再以350g 离心5min 。
8. 弃去上清液,将细胞溶于8ml 内皮细胞培养液(M l99 80ml、FBS 20ml 、PS 1ml 、L-Gln 2mM、ECGS 10mg/100ml 、Heparan 4000U/1 00ml 、Insulin mu/100ml)中,接种于预先包被2%明胶的T25 培养瓶中。
9. 细胞培养在37℃ 、5%CO2培养箱中, 24h 后换液,弃掉未贴壁细胞。之后每2~3d 换液1 次, 待细胞汇合时消化传代。

(三)细胞鉴定

体外培养成功的细胞,需进行纯度鉴定。可提供检测其特性来鉴定,如表达Ⅷ 因子、Weibel-Palade 小体,摄取乙酰化低密度脂蛋白,表达内皮细胞特异性抗原CD31 等。

(四)小结

培养的脐静脉内皮细胞是使用最规范的体外血管内皮细胞模型。其培养已较成熟。但由于其传代有限,往往需不断重复培养。另外,培养脐静脉内皮细胞时,最好能添加VEGF 或ECGS, 以刺激血管内皮细胞增殖,可增加传代数,获得较多的血管内皮细胞用于研究。

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