2022年 1月 28日, 星期五
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人胚胎肺成纤维细胞的培养

成纤维细胞作为体外最易培养成功的正常细胞,用途广泛。但由于其有限的传代寿命,通常用于细胞衰老的研究,在肿瘤研究中,常常作为正常细胞对照,用于研究细胞恶性转化的条件和影响因素。另外, 它也常用于药物毒性的检测。体外培养的成纤维细胞, 还用于疾病的诊断,如染色体异常疾病的筛选、先天性代谢遗传疾病的细胞化学及生物化学检验和鉴定。

(一)材料与设备

1.设备   超净工作台、离心机、CO2培养箱、-10℃冰箱、-20°C冰箱。
2. 无菌材料   大培养皿、青霉素小瓶、50ml 离心管、刻度吸管、弯头吸管、T25 培养瓶、手术剪、刀、镊、细胞筛(100 目)、消毒用乙醇棉球、流产胚胎、高糖DMEM 培养液、胎牛血清、青/链霉素、D-Hanks 溶液、0.25%胰蛋白酶/0.03%EDTA 消化液。

(二)操作步骤

1.消化法

(1)流产胚胎引出后,于4℃保存并尽快运输至实验室。
(2)将胚胎置大平皿中,用酒精棉球将胚胎进行整体擦拭消毒。
(3)持手术镊、剪,从胚胎腹部切口,向上扩,剪断肋骨,取出肺脏,去除外膜后,用D-Hanks 溶液(含双倍双抗)洗涤3~5 次,至组织呈灰白色。
(4)将组织剪碎至1mm3, 移入青霉素小瓶,加少星D-Hanks 溶液混匀,用弯头吸管将剪碎的组织移至50ml 离心管中加D-Hanks 溶液清洗,然后以每分钟1 000 转的速率离心6min 。
(5)弃上清,加入15ml 的0.25%胰蛋白酶/0.03%EDTA 消化液千室温下消化15min, 然后用吸管混匀,静置几秒钟,待组织块沉淀后弃去上清液。
(6)重新加入新鲜消化液15ml 消化10~15min, 混匀后将上清液(此时悬液中已含有消化下来的细胞)移入另一离心管中并用含20% 血清的DMEM 培养液终止消化,然后向原离心管中重新加入10~ 15ml 消化液消化,重复3~4 次。
(7)将消化后收集的细胞悬液混合,过细胞筛。
(8)筛后的细胞悬液移入离心管中,以每分钟1 000 转的速率离心6min, 弃去上清液,用含20%胎牛血清的DMEM 培养液混匀,此时可在计数板计数,然后将细胞悬液按每瓶6~8ml (含细胞量1 x 106 个)移入T25 培养瓶中,于37°C 、5% CO2培养箱中培养。次日,观察细胞贴壁情况,弃旧液,用D-Hanks 溶液清洗后,换新鲜培养液千37℃ 、5% CO2培养箱中继续培养。
(9) 原代培养的第三天,细胞长至80%~90% 汇合时,进行第一次传代。以后每3~4d 传代1次,按常规1 : 3 传代方法进行操作。

2. 组织块贴壁法

(1)流产胚胎引出后,于4℃保存并运输至实验室。
(2)将胚胎置大培养皿中,用乙醇棉球将胚胎进行整体擦拭消毒。
(3)待手术镊、剪, 从胚胎腹部切口,向上扩,剪断肋骨,取出肺脏,去除外膜后,用D-Hanks 溶液(含双倍双抗)洗涤3~5 次,至组织呈灰白色。
(4)将组织剪碎至1mm3, 移入青霉素小瓶,然后吸入D-Hanks 溶液清洗2~3 次。
(5) 将组织块移入T25 培养瓶,用弯头吸管将组织块轻轻剥离成单个,并均匀贴附在瓶壁,然后将贴附有组织块的培养瓶移入培养箱,翻转倒置4~6h, 至组织块贴牢。
(6)加入6~8ml 含20%胎牛血清的DMEM 培养液,于37℃ 、5% CO2 培养
箱中培养。
(7)3~7d 后于镜下观察,组织块周围会有细胞长出,细胞长多后就可看到“生长晕“。
(8) 原代培养过程中应保证每3d 换1 次培养液,细胞长至7~10d 时可进行第一次传代。以后每3~4d 传代1 次,按常规1 : 3 传代方法进行操作。

(三)小结

体外培养的皮肤成纤维细胞和包皮成纤维细胞最常用。前者可在门诊活检取材。注意要将脂肪组织、结缔组织去除干净。后者可利用手术切除组织。成纤维细胞体外培养,可传代20~50 次。细胞80%~90%汇合时就需传代。注意避免接触抑制和自发转化等。

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