2022年 1月 28日, 星期五
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人外周血B 淋巴细胞的转化

EB 病毒的特性之一是能使人外周血B 淋巴细胞转化,使其成为连续分裂,永久生存的类淋巴母细胞样细胞,即永生化细胞。每一永生细胞株都保存了原来提供血样个体的完整基因组,为研究世界上不同人种、不同民族的遗传结构,不同个体、不同人群对疾病的易感性,特别是对家族性遗传疾病和地方性疾病的易感性,提供了宝贵的遗传资源。

(一)材料与设备

1. 无菌材料   细胞培养瓶T25 、T75, 冻存管,一次性小滤器,一次性离心管15ml 、50ml, RPMI1640, 青/链霉素,肝素,胎牛血清, HEPES, 淋巴细胞分离液,环抱素A, EB 病毒, PHA, 二甲亚砜,冻存液,防护手套。
2. 设备   二级无菌操作柜、CO2 培养箱、4℃ 冰箱、-20℃ 冰箱、-70 °C 冰箱、离心机。

(二)实验步骤

1 .静脉取血3~4ml,加等量RPMI1640 (每毫升培养液含青霉素100U/链霉素100μg) 稀释血液,混匀。
2 . 15ml 离心管加4ml 淋巴细胞分离液,将稀释好的血液缓缓地加到淋巴细胞分离液液面上。
3. 离心,每分钟2500 转离心30min,或每分钟3000 转离心25min。
4. 淋巴细胞分离液液面上有一层白膜(即淋巴细胞),将白膜层轻轻吸出。移入15ml 离心管内。
5. 用RPMI 1640 (每毫升培养液含青霉素100U/链霉素100μg) 清洗3 次。
6. 第三次清洗完成后,弃去上清液把细胞轻轻悬起,加2ml 的RPMI1640完全培养液、1.2ml EB 病毒、0.4ml 环玸素A 、0.2mlPHA 把细胞轻轻混匀,然后分2 个细胞培养瓶, A、B 两条线进行培养, 37°C培养箱,无需CO2
7. 24h 后镜下观察, 如细胞明显增大并聚团,悬浮生长,则说明细胞转化成功。
8 .每隔1~2d 少量补液,当瓶内培养液量达到2/3 时,就需要半量换液,从培养瓶中取出体积的1/2 量或更多一点的培养液弃掉,加入等量的完全培养液。
9 .细胞冻存,当细胞量达到1 x107个时就可以冻存,每冻存管细胞量1 x 106~ 1.2×106。冻存前1d 需换新鲜培养液。
10 . 细胞放入冻存管后, 用棉花把冻存管包裹约2 寸厚放入-70℃冰箱, 24h后放入液氮罐中。

(三) EB 病毒的制备

1. 复苏B-958 细胞, 37℃ 水浴中解冻, 用10ml PBS 洗1 次,弃去上清液。
2 . 将细胞溶解于 8ml 的RPMl1640 宪全培养液中,接种于T25 细胞培养瓶中。
3 . 每隔1 ~2d 补充一定数量的培养液, 直至达到所需的毫升数时,饥饿4~7d, 收集上清液。
4. 于-70℃及37℃ 反复冻融3 次。
5. 以每分钟1500 转的速率离心15min 。
6. 过滤( 0.22μm )。
7. 分装1.5~ 10ml,,-70 ℃ 冰箱保存备用。

(四)试剂的配制

1 . 抗生素的配制   青霉素和链霉素, 一般配制的浓度为10000U/ml 和10 000μg/ml ,用无菌的D-hanks 溶液或生理盐水溶解,分装小瓶, 5ml/瓶,-20℃冰箱保存备用。用时每1 00ml 培养液加1ml 双抗(每毫升培养液含音霉素100U/链霉素100μg )
2 . 抗凝药   一般采用每毫升全血加25U 肝素抗凝。市售肝素每2ml 含12500U,取肝素0.4ml (2 500U) 加无菌生理盐水至10ml (浓度为250U/ml ), 分装, 放4℃ 冰箱保存备用。每毫升全血加0. 1ml 浓度为250U/ml 的肝素。
3. 1mo/L HEPES    称HEPES 粉末23.85g, 溶解在80ml 三蒸水中, 用1mol/L的NaOH 调pH 至7.0, 定容至100ml ,过滤除菌,分装小瓶, 4℃冰箱保存备用。
4. 环孢素A   每支5ml 含250mg。将5ml 环孢素A 分装小瓶,放4℃ 冰箱保存备用。使用时取20μl 的原液加入50ml 的RPMI 1640 内,配成20μl/ml ,分装0.4~0.8ml 一管, -20℃ 冰箱保存备用。
5. PHA   进口试剂、国产试剂均可, 10mg PHA, 加生理盐水5ml 溶解, 分装小瓶, 4℃冰箱保存备用(使用浓度为50μg/ml ) 。
6. 胎牛血清   Gibco 或Hyclone 公司生产的优质胎牛血清, 56℃灭活30min 。
7. RPMI1640   完全培养液的配制RPMI 1640 、15%胎牛血清、1%双抗、18mmol/L HEPES 。
8 . 转化用培养基的配制   2ml RPMI 1640 完全培养液、1.2ml EB 病毒、0.4ml环孢素A、0.2mlPHA (第一次转化使用)
9. 冻存液的配制   95%的胎牛血清、5%的二甲亚砜,分装,-20℃ 冰箱保存备用。使用时1ml 可用于冻存1 管。

(五)小结

I. 在细胞建株时,应分A 、B 两条线进行培养。
2. 第一次转化时,培养液的pH 应为6.8~7.2 。
3. 整个实验过程均需要戴手套进行。
4. 为控制污染, 应用二级无菌操作柜进行。
5. 在丢弃与转化淋巴细胞及培养液接触的所有材料前,必须进行消毒。

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