2022年 1月 28日, 星期五
新闻

一步法同时提取细胞或组织中的DNA 、RNA 和蛋白质

本方案(Chomczynski1993) 可以从部分组织或细胞中同时提取RNA 、DNA 和蛋白质。像它的前身(Chomczynski and Sacchi 1987) 一样,此方法涉及用异硫氰酸胍和苯酚的单相溶液裂解细胞。加入氯仿产生第二(有机)相,从而DNA 和蛋白质被抽提,而RNA留在水相上清中。有机相中DNA 和蛋白质的分离,通过按顺序用乙醇、异丙醇进行沉淀。从有机相中回收的DNA 是20kb 大小、适合进行PCR 反应的模板。蛋白质由于暴露在胍中,而变性则主要用于免疫反应。用异丙醇从水相中沉淀出的RNA 可通过色谱法在寡核苷酸-纤维素柱进一步纯化和/或用于Northern 杂交、反转录或RT-PCR 。

总RNA 的产率因组织或细胞来源而异,但一般而言,组织的初始产量为4~7μg/mg ,细胞为5 ~ 10 mg/107 个细胞,所提取的RNA 的A260/A280 比值为1.8 ~ 2.0 。

材料
准备本方案中的所有试剂均需要用DEPC 处理的水。

试剂

细胞或组织

氯仿

DEPC 处理过的水

十五水拧檬酸二钠( 0.8mol/U) 不需调整pH 。

乙醇(75%)

异丙醇

液氮

单相裂解试剂

氯化钠( 1.2 mol/L)

磷酸盐缓冲盐水(PBS) ,冰冷(可选,见步骤1)仅适用于重悬和单层细胞生长所需的。

RNA 沉淀溶液

SDS (20%, m/V) (可选,见步骤7 )

设备

用于测量在260nm 处吸光度的比色皿

组织匀浆器

低中速离心机和转子

DEPC 处理水清洗过的研钵和杵,预冷

聚丙烯带封盖的管

65°C 水浴(可选,见步骤7)

方法

  1. 准备细胞或组织样品提取RNA 。

对于组织样品

处理含有丰富的蛋白质分解酵素的组织如胰腺或肠道时,最好将组织先切成小块( 100mg ) ,然后直接放入液氮中。快速冷冻的组织可以被转移到-70°C 保存或立即用于提取RNA  。组织可以存储于-70°C 数月而不影响RNA的产量或完整性。

冷冻和粉碎并不是必需的。不含有丰富的RNase 的组织可以被迅速剁碎成小块,并直接转入加有适量溶液D (步骤l.iii ) 的聚丙烯snap-cap 管中。

i 分离出所需组织,并立即将它们放置在液氮中。

ii 将约100mg 的冷冻组织转移到含有液氮的研钵中,并用杵粉碎。在粉碎过程中添加液氮以保持组织的冷冻状态。

iii . 转移粉状组织至还有lmL 冰冷单相裂解试剂的聚丙烯snap-cap 管中。

iv 在室温下用Polytron 匀浆器匀浆组织15~30s 。

对于悬浮培养的哺乳动物细胞

i 通过200 ~ 1900g 离心5 ~ 10min 收获细胞。

ii 弃培养基,用1 ~ 2mL 的无菌冰冷PBS 重悬细胞沉淀。

iii 通过离心收集细胞,弃去PBS, 按每106 个细胞加lmL 单相裂解试剂比例加入单相裂解试剂。

iv 在室温下用Polytron 匀浆器匀浆组织15 ~ 30s 。

对于单层哺乳动物细胞

i 弃去培养基,并用5~10mL 无菌冰冷的PBS 漂洗细胞一次。

ii 弃去PBS, 按一个90mm 培养皿加入lmL 单相裂解试剂比例加入单相裂解试剂裂解细胞(每60mm 培养皿0.7mL) 。

iii. 细胞裂解液转移到聚丙烯snap-cap 管中。

iv . 在室温下用Polytron 匀浆器匀浆组织15 ~ 30s 。

  1. 在室温下孵育5min, 以完全分离核蛋白复合物。
  2. 每毫升单相裂解试剂添加0.2mL 氯仿。剧烈振动或涡旋以混合样品。
  3. 4°C 以12000r/min 离心15min, 分离成两相的混合物。将上层水相转移到新的管中。

DNA 和蛋白质提取到有机相中, RNA 留在水相中。DNA 和蛋白质可能通过顺序用乙醇、异丙醇沉淀,并从有机相中回收

   5 . 从水相中沉淀的RNA : 对于每个初始毫升的单相裂解试剂,加入0.25 倍体积的异丙醇和0 .2 5 倍体积沉淀RNA 溶液。彻底混合后,室温下放置10min 。

  1. 微型离心机4 °C 以最大的速度离心10min 收集沉淀出的RNA 。用75%乙醇洗涤沉淀两次,再离心。用一次性吸头清除残留的乙醇。敞开放置数分钟使乙醇挥发,不要让沉淀完全干燥。
  2. 加入50~100mL DEPC 处理过的水, -70℃ 储存RNA 溶液。

加入0.5 % SDS, 然后加热至65℃ 可协助溶解沉淀。

  8.估计RNA 的浓度。

推荐

无菌操作的注意事项及常见问题

做不同的实验,操作上会有小小的 …

发表评论

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注