英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
本方案(Chomczynski1993) 可以从部分组织或细胞中同时提取RNA 、DNA 和蛋白质。像它的前身(Chomczynski and Sacchi 1987) 一样，此方法涉及用异硫氰酸胍和苯酚的单相溶液裂解细胞。加入氯仿产生第二（有机）相，从而DNA 和蛋白质被抽提，而RNA留在水相上清中。有机相中DNA 和蛋白质的分离，通过按顺序用乙醇、异丙醇进行沉淀。从有机相中回收的DNA 是20kb 大小、适合进行PCR 反应的模板。蛋白质由于暴露在胍中，而变性则主要用于免疫反应。用异丙醇从水相中沉淀出的RNA 可通过色谱法在寡核苷酸-纤维素柱进一步纯化和/或用于Northern 杂交、反转录或RT-PCR 。
总RNA 的产率因组织或细胞来源而异，但一般而言，组织的初始产量为4~7μg/mg ,细胞为5 ~ 10 mg/107 个细胞，所提取的RNA 的A260/A280 比值为1.8 ~ 2.0 。
材料
准备本方案中的所有试剂均需要用DEPC 处理的水。
试剂
细胞或组织
氯仿
DEPC 处理过的水
十五水拧檬酸二钠( 0.8mol/U） 不需调整pH 。
乙醇（75%)
异丙醇
液氮
单相裂解试剂
氯化钠( 1.2 mol/L)
磷酸盐缓冲盐水(PBS) ，冰冷（可选，见步骤1)仅适用于重悬和单层细胞生长所需的。
RNA 沉淀溶液
SDS (20%, m/V) （可选，见步骤7 )
设备
用于测量在260nm 处吸光度的比色皿
组织匀浆器
低中速离心机和转子
DEPC 处理水清洗过的研钵和杵，预冷
聚丙烯带封盖的管
65°C 水浴（可选，见步骤7)
方法
- 准备细胞或组织样品提取RNA 。
对于组织样品
处理含有丰富的蛋白质分解酵素的组织如胰腺或肠道时，最好将组织先切成小块( 100mg ) ，然后直接放入液氮中。快速冷冻的组织可以被转移到－70°C 保存或立即用于提取RNA 。组织可以存储于－70°C 数月而不影响RNA的产量或完整性。
冷冻和粉碎并不是必需的。不含有丰富的RNase 的组织可以被迅速剁碎成小块，并直接转入加有适量溶液D （步骤l.iii ) 的聚丙烯snap-cap 管中。
i 分离出所需组织，并立即将它们放置在液氮中。
ii 将约100mg 的冷冻组织转移到含有液氮的研钵中，并用杵粉碎。在粉碎过程中添加液氮以保持组织的冷冻状态。
iii . 转移粉状组织至还有lmL 冰冷单相裂解试剂的聚丙烯snap-cap 管中。
iv 在室温下用Polytron 匀浆器匀浆组织15~30s 。
对于悬浮培养的哺乳动物细胞
i 通过200 ~ 1900g 离心5 ~ 10min 收获细胞。
ii 弃培养基，用1 ~ 2mL 的无菌冰冷PBS 重悬细胞沉淀。
iii 通过离心收集细胞，弃去PBS, 按每106 个细胞加lmL 单相裂解试剂比例加入单相裂解试剂。
iv 在室温下用Polytron 匀浆器匀浆组织15 ~ 30s 。
对于单层哺乳动物细胞
i 弃去培养基，并用5~10mL 无菌冰冷的PBS 漂洗细胞一次。
ii 弃去PBS, 按一个90mm 培养皿加入lmL 单相裂解试剂比例加入单相裂解试剂裂解细胞（每60mm 培养皿0.7mL) 。
iii. 细胞裂解液转移到聚丙烯snap-cap 管中。
iv . 在室温下用Polytron 匀浆器匀浆组织15 ~ 30s 。
- 在室温下孵育5min, 以完全分离核蛋白复合物。
- 每毫升单相裂解试剂添加0.2mL 氯仿。剧烈振动或涡旋以混合样品。
- 4°C 以12000r/min 离心15min, 分离成两相的混合物。将上层水相转移到新的管中。
DNA 和蛋白质提取到有机相中， RNA 留在水相中。DNA 和蛋白质可能通过顺序用乙醇、异丙醇沉淀，并从有机相中回收
5 . 从水相中沉淀的RNA : 对于每个初始毫升的单相裂解试剂，加入0.25 倍体积的异丙醇和0 .2 5 倍体积沉淀RNA 溶液。彻底混合后，室温下放置10min 。
- 微型离心机4 °C 以最大的速度离心10min 收集沉淀出的RNA 。用75％乙醇洗涤沉淀两次，再离心。用一次性吸头清除残留的乙醇。敞开放置数分钟使乙醇挥发，不要让沉淀完全干燥。
- 加入50~100mL DEPC 处理过的水， -70℃ 储存RNA 溶液。
加入0.5 % SDS, 然后加热至65℃ 可协助溶解沉淀。
8.估计RNA 的浓度。