PCR实验最常见的9个问题及解决方案

1. 如何有效设计引物

(1)使用Oligo或Primer设计引物,在保守区内设计,长度一般在18-27bp,上下游引物Tm值最好是60-75℃,GC含量=40%-60%,引物自身及引物之间不应存在互补序列,避免发夹结构。

2. PCR电泳无扩增条带

(1)酶失活或在反应体系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或运输不当而失活,往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

(2)模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸,造成DNA脱嘌呤而影响PCR的结果。

(3)变性温度是否准确:PCR仪指示温度与实际温度是否相符,过高酶在前几个循环就迅速失活;过低则模板变性不彻底。

(4)反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶,应在未加Taq酶以前,将反应体系95℃加热5-10分钟。

(5)引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化,或因储存条件不当而失活。

(6)引物错误。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

(7)DNA凝胶电泳时加入阳性对照,确保不是DNA凝胶和PCR程序的问题。

3. PCR产物量过少

(1)退火温度不合适。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

(2)DNA模板量太少。增加DNA模板量。

(3)PCR循环数不足。增加反应循环数。

(4)引物量不足。增加体系中引物含量。

(5)延伸时间太短。以1kb/分钟的原则设置延伸时间。

(6)变性时间过长。变性时间过长会导致DNA聚合酶失活。

(7)DNA模板中存在抑制剂。确保DNA模板干净

4. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散

(1)酶量过高。减少酶量;酶的质量差,调换另一来源的酶。

(2)dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。

(3)MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。

(4)模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng。

(5)引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。

(6)循环次数过多;增加模板量减少循环次数至30,缩短退火时间及延伸时间,或改用二种温度的PCR循环。

(7)退火温度过低。

(8)电泳体系有问题:

①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大;

②凝胶没有凝固好;

③琼脂糖质量差。

(9)若为PCR试剂盒则可能:

①由于运输储存不当引起试剂盒失效;

②试剂盒本身质量有问题,如引物选择、循环参数等选择不当。

(10)降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

5. 扩增产物出现多条带(杂带)

(1)引物用量偏大,引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。

(2)循环的次数过多。适当增加模板的量,减少循环次数。

(3)酶的用量偏高或酶的质量不好,应降低酶量或调换另一来源的酶。

(4)退火温度偏低,退火及延伸时间偏长。应提高退火温度,减少变性与延伸时间,也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

(5)样品处理不当。

(6)Mg2+浓度偏高,因适当调整Mg2+使用浓度。

(7)若为PCR试剂盒,也可能时试剂盒本身质量有问题。

(8)复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。

(9)反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。

(10)引物特异性差。利用BLAST检查引物特异性或重新设计引物。

(11)引物量过多。减少反应体系中引物的用量。

(12)模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng。

(13)外源DNA污染。确保操作的洁净。

6. 阴性对照出现条带

(1)试剂,枪头,工作台污染。使用全新的试剂和枪头,对工作台进行清洁。

7. 条带大小与理论不符

(1)污染。使用全新的试剂和枪头,对工作台进行清洁。

(2)模板或引物使用错误。查看引物是否会扩增部分条带和模板是否正确。

3)基因亚型。对研究的基因进行序列分析和BLAST研究。

8. 持续出现假性条带

(1)起始退火温度太低,或目的扩增产物和非目的产物的T值相差不大。可尝试适当提高PCR温度或者设置降落PCR,降低循环数。

9. 菌落PCR检测有条带,接种大摇后无条带

(1)可重新以菌落和菌液为模板进行PCR对照检测,因为菌落PCR的假阳性概率还是比较高。如果仍出现上述结果,推测可能是平板上连接液中的未连接载体的扩增引起的目的条带,进一步质粒PCR检测,可证明目的片段是否真正连接成功。

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