2022年 9月 28日, 星期三
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如何做好Northern Blot实验?

  • 准备阶段:
    1.180度烤器皿:三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。电泳槽:清洗梳子和电泳槽,并用双氧水浸泡过夜,用DEPC水冲洗,干燥备用。处理DEPC水(2 L)备用。
    2.用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子,电泳槽,刀片等,然后用DEPC水冲洗二次,去除RNAZap。
  • 制胶:
    1. 称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中,加入32.4mlDEPC水后,微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)
    2. 在通风厨中加入3.6ml的10*Denaturing Gel buffer,轻轻振荡混匀。注意尽量避免产生气泡。
    3. 将熔胶倒入制胶板中,插上梳子如果胶溶液上存在气泡,可以用热的玻璃棒或其它方法去除,或将气泡推到胶的边缘。注:胶的厚度不能超过0.5cm。
    4. 胶在室温下完全凝固后,将胶转移到电泳槽中,加入1x MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm,小心拔出梳子。(配制250ml 1×MOPS Gel Running buffer,在电泳过程中补充蒸发的buffer。)
    5. 检查点样孔。

  • RNA样品的制备
    在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB(终浓度为10μg/ml)。混匀后,65℃空气浴15min。短暂低速离心后,立即放置于冰上5min。
  • 电泳:
    1.将RNA样品小心加到点样孔中。
    2.在5V/cm下跑胶(5x14cm)。在电泳过程中,每隔30min短暂停止电泳,取出胶,混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝(500bp)接近胶的边缘时终止电泳。
    3.紫外灯下,检验电泳情况,并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。

  • 转膜
    1.用3%双氧水浸泡真空转移仪后,用DEPC水冲洗。
    2.用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏,用DEPC水冲洗二次。
    3.连接真空泵和真空转移仪,剪取一块适当大小的膜(膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5mm),膜在Transfer buffer浸湿5分钟后,放置在多孔渗水屏的适当位置。
    4.盖上塑胶屏,盖上外框,扣上锁。
    5.将胶的多余部分切除,切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔,并至少盖过边缘约2mm,以防止漏气。
    6.将胶小心放置在膜的上面,膜与胶之间不能有气泡。
    7.打开真空泵,使压强维持在50~58mbar;立即将transfer buffer加到胶面和四周。每隔10min在胶面加上1ml transfer buffer,真空转移2小时。
    8.转膜后,用镊子夹住膜,于1x MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10秒,去除残余的胶和盐。
    9.用吸水纸吸取膜上多余的液体后,将膜置于UV交联仪中自动交联。
    10.将胶和紫外交联后的膜,在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)
    11.将膜在-20℃保存。

  • 探针的制备
    1. 在1.5ml离心管中配制以下反应液:模板DNA(25 ng)1μl
    Random Primer 2ul灭菌水 11ul总体积:14μl
    2. 95°C加热3分钟后,迅速放置于冰冷却5min。
    3. 在离心管中按下列顺序加入以下溶液:
    10×Buffer 2.5μl
    dNTP Mixture 2.5ul
    111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 μl
    Exo-free Klenow Fragment 1 μl
    4. 混匀后(25μl),37°C下反应30分钟。短暂离心,收集溶液到管底。
    5. 65°C加热5min使酶失活。
       
  • 探针的纯化及比活性测定:
    1. 准备凝胶:将1g凝胶加入30ml的DEPC水中,浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次,以除去可溶解的葡聚糖。
    2.取1ml一次性注射器,去除内芯推扞,将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住,在注射器中装填Sephadex G-50凝胶。
    3. 将注射器放入一支15ml离心管中,注射器把手架在离心管口上。1600g离心4分钟,凝胶压紧后,补加Sephadex G-50凝胶悬液,重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml刻度处
    4. 100μl STE缓冲液洗柱,1600g离心4min。重复3次。
    5. 倒掉离心管中的溶液后,将一去盖的1.5ml离心管置于管中,再将装填了Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中,注射器口对准1.5ml离心管。
    6. 将标记的DNA样品加入25μl STE,取出0.5ul点样于DE8-paper上,其余上样于层析柱上。
    7. 1600g离心4min,DNA将流出被收集在去盖的离心管中,而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。取0.5μl己纯化的探针点样于DE8-paper.
    8. 测比活性。 

  • 预杂交:
    1. 将预杂交液在杂交炉中68℃预热,并漩涡使未溶解的物质溶解。
    2.加入适当的ULRAhyb到杂交管中(以100cm2膜面积加入10mlULRAhyb杂交液),42℃预杂交4 hr。

  • 探针变性:
    1. 用10 mM EDTA将探针稀释10倍。
    2. 90℃热处理稀释后探针10min后,立即放置于冰上5min。
    3. 短暂离心,将溶液收集到管底。

  • 杂交
    1. 加入0.5ml ULTRAhyb到变性的探针中,混匀后,将探针加到预杂交液中。
    2. 42℃杂交过夜(14~24hr)。杂交完后,将杂交液收集起来于-20℃保存。

  • 洗膜
    1. 低严紧性洗膜:加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液),室温下,摇动洗膜5min两次。
    2. 高严紧性洗膜: 加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液),42℃ 摇动洗膜20min两次。

  • 曝光:
    1. 将膜从洗膜液中取出,用保鲜膜包住,以防止膜干燥。
    2. 检查膜上放射性强度,估计曝光时间
    3. 将X光底片覆盖与膜上,曝光
    4. 冲洗X光底片,扫描记录结果。

  • 去除膜上的探针
    将200ml 0.1%SDS(由DEPC水配制)煮沸后,将膜放入,室温下让SDS冷却到室温,取出膜,去除多余的液体,干燥后,可以保存几个月。

  • 杂交结果
    操作应该小心,但不必紧张。用于RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去RNAse酶,以免样品的降解。转膜时,注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡

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