如何做好Northern Blot实验？
james
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- 准备阶段：
1.180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。处理DEPC水(2 L)备用。
2.用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。
- 制胶：
1. 称取0.36mg琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)
2. 在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。注意尽量避免产生气泡。
3. 将熔胶倒入制胶板中，插上梳子如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。注：胶的厚度不能超过0.5cm。
4. 胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。（配制250ml 1×MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。）
5. 检查点样孔。
- RNA样品的制备
在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB（终浓度为10μg/ml）。混匀后，65℃空气浴15min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。
- 电泳：
1.将RNA样品小心加到点样孔中。
2.在5V/cm下跑胶（5ｘ14cm）。在电泳过程中，每隔30min短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝（500bp）接近胶的边缘时终止电泳。
3.紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间。
- 转膜
1．用3%双氧水浸泡真空转移仪后，用DEPC水冲洗。
2．用RNAZap擦洗多孔渗水屏和塑胶屏，用DEPC水冲洗二次。
3．连接真空泵和真空转移仪，剪取一块适当大小的膜（膜的四边缘应大于塑胶屏孔口的5mm），膜在Transfer buffer浸湿5分钟后，放置在多孔渗水屏的适当位置。
4．盖上塑胶屏，盖上外框，扣上锁。
5．将胶的多余部分切除，切后的胶四边缘要能盖过塑胶屏孔，并至少盖过边缘约2mm，以防止漏气。
6．将胶小心放置在膜的上面，膜与胶之间不能有气泡。
7．打开真空泵，使压强维持在50~58mbar；立即将transfer buffer加到胶面和四周。每隔10min在胶面加上1ml transfer buffer，真空转移2小时。
8．转膜后，用镊子夹住膜，于1x MOPS Gel Running buffer中轻轻泡洗10秒，去除残余的胶和盐。
9．用吸水纸吸取膜上多余的液体后，将膜置于UV交联仪中自动交联。
10．将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间)
11．将膜在-20℃保存。
- 探针的制备
1. 在1.5ml离心管中配制以下反应液：模板DNA(25 ng)1μl
Random Primer 2ul灭菌水 11ul总体积：14μl
2. 95°C加热3分钟后，迅速放置于冰冷却5min。
3. 在离心管中按下列顺序加入以下溶液：
10×Buffer 2.5μl
dNTP Mixture 2.5ul
111 TBq/mmol[a-32P]dCTP 5 μl
Exo-free Klenow Fragment 1 μl
4. 混匀后（25μl），37°C下反应30分钟。短暂离心，收集溶液到管底。
5. 65°C加热5min使酶失活。
- 探针的纯化及比活性测定：
1. 准备凝胶：将1g凝胶加入30ml的DEPC水中，浸泡过夜。用DEPC水洗涤膨胀的凝胶数次，以除去可溶解的葡聚糖。
2.取1ml一次性注射器，去除内芯推扞，将注射器底部用硅化的玻璃纤维塞住，在注射器中装填Sephadex G-50凝胶。
3. 将注射器放入一支15ml离心管中，注射器把手架在离心管口上。1600g离心4分钟，凝胶压紧后，补加Sephadex G-50凝胶悬液，重复此步直至凝胶柱高度达注射器0.9ml刻度处
4. 100μl STE缓冲液洗柱，1600g离心4min。重复3次。
5. 倒掉离心管中的溶液后，将一去盖的1.5ml离心管置于管中，再将装填了Sephadex G-50凝胶的注射器插入离心管中，注射器口对准1.5ml离心管。
6. 将标记的DNA样品加入25μl STE，取出0.5ul点样于DE8-paper上，其余上样于层析柱上。
7. 1600g离心4min，DNA将流出被收集在去盖的离心管中，而未掺入DNA的dNTP则保留在层析柱中。取0.5μl己纯化的探针点样于DE8-paper.
8. 测比活性。
- 预杂交：
1. 将预杂交液在杂交炉中68℃预热，并漩涡使未溶解的物质溶解。
2.加入适当的ULRAhyb到杂交管中(以100cm2膜面积加入10mlULRAhyb杂交液)，42℃预杂交4 hr。
- 探针变性：
1. 用10 mM EDTA将探针稀释10倍。
2. 90℃热处理稀释后探针10min后，立即放置于冰上5min。
3. 短暂离心，将溶液收集到管底。
- 杂交：
1. 加入0.5ml ULTRAhyb到变性的探针中，混匀后，将探针加到预杂交液中。
2. 42℃杂交过夜（14~24hr）。杂交完后，将杂交液收集起来于－20℃保存。
- 洗膜：
1. 低严紧性洗膜：加入Low Stringency Wash Solution#1 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液)，室温下，摇动洗膜5min两次。
2. 高严紧性洗膜： 加入High Stringency Wash Solution#2 (100cm2膜面积加入20ml洗膜溶液)，42℃ 摇动洗膜20min两次。
- 曝光：
1. 将膜从洗膜液中取出，用保鲜膜包住，以防止膜干燥。
2. 检查膜上放射性强度，估计曝光时间
3. 将X光底片覆盖与膜上，曝光
4. 冲洗X光底片，扫描记录结果。
- 去除膜上的探针：
将200ml 0.1%SDS（由DEPC水配制）煮沸后，将膜放入，室温下让SDS冷却到室温，取出膜，去除多余的液体，干燥后，可以保存几个月。
- 杂交结果
操作应该小心，但不必紧张。用于RNA电泳、转膜的所有器械、用具均须处理以除去RNAse酶，以免样品的降解。转膜时，注意膜和多孔渗水屏之间不要有气泡
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