2022年 1月 28日, 星期五
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蛋白质凝胶电泳注意事项

大多数蛋白质凝胶电泳是还原性条件下的十二烧基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS- PAGE) 。

*样品准备

还原试剂2-巯基乙醇或者二硫苏糖醇加在变性胶的样品缓冲液中,还原蛋白质中的二硫键,确保蛋白质维持在测定分子量所需的无规则卷曲状态。

  • 样品缓冲液分成小管,贮于-20℃ 。甘油浓度很高,足以防止样品冻结,所以不必担心冻融所造成的损伤。当管中没有还原试剂的味道时,就该取用一管新的还原试剂了。
  • SDS-PAGE: 2 x 缓冲液包含4% SDS 、20% 甘油、10% 2-巯基乙醇(或100 mmol/L二硫苏糖醇),0.004% 溴酚蓝, 0.125mol/L Tris-HCI, pH 近似于6.8 。
  • 样品必须在即将上样之前,在样品缓冲液中煮沸(或95℃ 加热)5min 。如果在烧杯或者水浴锅中加热,使用漂浮管架。必要时,可以用苯乙烯塑料,戳上几个洞即可。煮沸后管子置于冰上冷却。打开盖子时,紧紧抓住管子,万一管内压力没有完全释放,可以防止盖子弹出。
  • 如果盖紧盖子煮样品,盖子有可能弹开,整个管子可能爆到空中。有几种方法可以避免这种情况:可以等到样品即将开始爆炸时,轻轻打开管子释放压力;可以用针在每个管子盖上戳一个小孔,但这不能用于放射性样品。有几种煮样品用的架子, 可以将小管子的盖子紧紧夹住, 防止它弹开。最佳解决之道是使用一个塑料夹子,套紧小管的盖子防止其弹开。

*标准参照物/分子质量标记

  • 标准参照物有高范围、低范围以及宽范围的。市售的有未染色的或预染色的,预染色的更方便使用。除非另有说明,标准参照物应贮于-20 ‘C 。
  • 染料与标准分子质量标记的共价结合使蛋白质分子质量产生变化。要精确测定分子质量应使用经校准的分子质量标准参照。
  • 生物素化的标准参照可以引入到免疫印迹的辣根过氧化物酶(HRP) 或碱性磷酸酶检测步骤中。其他标记参照是设计用于银染或其他染色方法的。
  • 大多数的标记参照是为SDS- PAGE 设计的。如果是非变性胶,必须使用用于非变性胶的标记参照。

*样式

  • 聚丙烯酰胺凝胶总是倒在两块玻璃板之间。两块玻璃板有间隔片分开。间隔片有不同的厚度,与相同厚度的梳子配套使用。
  • 连续胶VS非连续胶。连续胶系统有一块在阴极与阳极之间使用同一种缓冲液的分离胶。非连续胶分两个部分:浓缩胶(大孔胶)铺陈于分离胶之上。在非连续胶系统中,阴极与阳极之间使用不同的缓冲液。非连续胶系统的分辨率好。
  • 双向凝胶用来更精确地分析蛋白质,样品电泳两次,分别被称为第一相与第二相。第一相是一个等电聚焦凝胶(IEF) ,一般以管状胶的形式电泳,以确定各蛋白质的等电点。然后将胶放置在板状胶的上面以备第二相电泳,根据分子质量大小电泳后使蛋白质得到分开。
  • 管状凝胶VS板状凝胶。管状凝胶曾经用于一般电泳,现在仅用于双向电泳的第一相。

*凝胶

  • 38 : 1 (聚丙烯酰胺BIS 的质量比)质量比是蛋白质凝胶制胶所用贮液的通常比例。制胶时,取用不同的38 : 1 混合物的量,以制得不同丙烯酰胺浓度的胶。
  • 梯度胶或非梯度胶。非梯度胶的丙烯酰胺就一个百分比浓度,能将一个条带与周围条带分开,适于观察分子量相近的两条条带。梯度胶则能将大分子量的条带与小分子量的条带在同一块胶上得到分离。
  • 变性胶或非变性胶。因为蛋白质是两性化合物,它们的净电荷是由所处环境的pH 值决定的。根据蛋内质的pKa 与周围介质的pH 值某蛋白质会被吸引到阴极或者阳极。因此,在非变性条件下,蛋白质的电泳分离是由该蛋白质的大小与电荷共同决定的,在变性条件下的分离只由大小决定。
  • SDS-PAGE。SDS 是阴离子型去污剂,使蛋白质变性带上负电荷。在变性条件下电泳,电荷不再是一个影响囚素,蛋白质的电泳迁移只依赖于分子质量。

*缓冲液

  • 大多数蛋白质凝胶应用甘氨酸-Tris 缓冲液(196 mmol/L 甘氨酸/ 0 . 1 % SDS/50mmol/L Tris-HCI, pH 8.3) 。配制至少2L 的l0 X 缓冲液,室温保存。
  • Tricine [ 三(轻基)甲基甘氨酸]缓冲液用于肽与小蛋白质(2~80 kDa) 的电泳。

*电源

  • 25~30 mA (200V) 条件下电泳。通常在染料前沿到达胶的底部时停止电泳。
  • 蛋白质穿行于浓缩胶时,电泳要慢一点,低于50 V 。一旦样品处于浓缩胶与分离胶的界面时,可以调高电压至200 V 。

*染色

  • 电泳之后凝胶的染色是与染色液一起温浴,然后多次洗涤以除去多余染料。
  • 最常用的染色液是0.2% 考马斯亮蓝,在45 : 45 : 10 的甲醇:水: 乙酸混合液中37℃摇染2~3 个小时。用25 :65: 10 的甲醇:水:乙酸脱色。
  • 银染是更灵敏的染色方法,用于考马斯亮蓝染色很淡或根本不染色的蛋白质的染色。使用起来也更复杂。

 

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