2022年 1月 28日, 星期五
新闻

做电泳实验必须要知道的基础知识

*样品制备

  • 样品必须完全溶解于上样缓冲液,否则不能在凝胶中移动。样品太浓可能产生假相。
  • 样品缓冲液包含盐类(维持样品)、甘油(增加重量从而使样品下沉至点样孔)、以及示踪染料(以便监测电泳进程)。
  • 样品缓冲液可以分装成小部分冻存。
  • 缓冲液加到凝胶上之后才能点样。
  • 样品缓冲液中的示踪染料可以指示什么时候终止电泳。两种最常用的染料是漠酚蓝(BPB) 与二甲基苯青FF 。

*标准分子质量

  • 标准分子质量应同时电泳,用来检测电泳进展以及分析结果。
  • 使用相适应的标准分子质量。
  • 胶连同分子质量标准物一起拍照。标上各条带的大小。
  • 标准分子质量有带标记的与不带标记的两种。标记可以是荧光、发光体或者放射性元素。如果手边没有带标记的标准物,可以将染色后的胶与事后标记的印迹相比较。
  • 在每一块胶的同一泳道点上标准物。把标准物加在第一个泳道,就能知道胶的方向。
  • 点上正对照与负对照。

*样式

  • 琼脂糖凝胶一般以水平方向进行电泳,而聚丙烯酰胺凝胶则是以垂直方向进行电泳。潜水型胶是一种水平方向胶,凝胶被浸淹在电泳槽的底部。
  • 凝胶可以制成多种大小。测序胶必须制成大胶,但是对于大多筛选与转移用胶,甚至包括双向凝胶来说,只要不是把分子量相近的条带区分割,小型胶就可以了。
  • 毛细管电泳利用开口狭小的毛细管来进行DNA 、蛋白质和其他小分子的自动高效分离。分离是与检测分析相连,就像色谱仪器一样。只有专门实验室才有毛细管电泳设备。

*凝胶

  • 聚丙烯酰胺VS 琼脂糖。尽管凝胶电泳可以在滤纸、醋酸纤维素、淀粉或者其他基质上进行,大多数研究者还是只采用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶。两种都是多孔性胶,像分子筛样起作用(聚丙烯酰胺或者琼脂糖的百分比越高孔越小)。理论上,任何一种都可以用来分离DNA 、RNA 或者蛋白质。但是,聚丙烯酰胺在低百分比浓度时很软,难以用手操作。一般采用高百分比浓度,用以分析蛋白质和小核苷酸。
  • 低百分比琼脂糖凝胶相对较硬,易于操作,用来分离目的分子,如DNA和RNA或者巨大的蛋白质和蛋白质复体。
  • 胶的浓度必须与片断大小相适应。
  • 每次切去胶的同一小角。这样,万一胶掉落、翻转或在转移过程中放置凝胶,都能给定位做参考。

*缓冲液

  • 大多数电泳缓冲液配成高浓度母液,在电泳前稀释。
  • 每一种缓冲液在某一电流时会有特定的电压。要认识每一种缓冲液的特性,这样,出错时,就马上可以注意到。

*电源

  • 电源输出有几种模式:稳压(mV) 、稳流(安培,或者简称安)以及稳功率(瓦特,瓦) 。许多型号允许设定程序,在各种模式之间自动转换。这样可以使用最佳的电压( 在电泳过程中可能发生变化)同时不超出容量。
  • 不是所有的电源输出装置都相同,所以不能简单地将电泳装置接到任意装置上。要清楚你需要什么电流或者电压,然后找出需要的装置。
  • 大多数实验室都有不止一个电源装置用于测序胶(要求高电压)、电泳转移(要求高电流)以及用于琼脂糖和聚丙烯酰胺电泳(使用大范围的电压)的装置。很少有电源装置能同时满足所有的要求。
  • 变性蛋白胶与DNA和RNA胶中的样品会从负极(阴极)移到正极(阳极) 。用红色导线接正极(+),黑色导线接负极(一)。可以用同一个电源输出装置同时进行几块胶的电泳,但是没问过其他人前不要这样做,因为电泳条件会发生变化。
  • 设置闹钟提醒自己察看胶。特别是当你要察看低分子质量的分子时,样品很容易跑出胶进入缓冲液中。
  • 接触任何东西前,确信电泳装置必须处于断电状态。如果电源没被切断,不要进行任何操作!

    电流效应

             电流(mA) 效应
    交流电 直流电
    ≤1 5 没有感觉
    1~8   电击感觉, 不疼
    8~15   疼痛性电击,个别人可以摆脱紧握
    15~20 75 肌肉控制丧失,不能摆脱紧握
    20~50   肌肉收缩,呼吸困难
    50~100 300~500 可能会出现心室纤维颤动
    100~200   心室纤维颤动
    ≥200   严重灼伤,肌肉收缩严重以致心跳停止

*固定

  • 凝胶是否需要固定取决于用途。需要染色的胶一般需要固定,而用于转移的胶则不需要固定。

*干燥

  • 通过出去胶上的水,胶基质变薄。干燥之后的胶在放射自显影后条带更清晰。
  • 在凝胶干燥仪上干燥一块胶不需1小时。凝胶干燥仪可以加热,从而加快干燥过程。

*染色

  • DNA与RNA的染色可以通过在电泳前把染料加到样品中完成,也可以在事后染色。
  • 蛋白质胶在电泳后染色。

*记录

  • 凝胶经溴化乙锭染色后的Polaroid照片与蛋白质凝胶的35 mm照片是最常用的记录方式。
  • 数字记录与分析系统最常使用,所有数据可以直接用来演示。
  • 各种转移的记录方式取决于体系与实验。例如,放射自显影与化学发光结果可以记录在X射线胶片上,而信号可用光密度计定量。

*确定分子质量

  • 蛋白质的分子质量可用SDS-PAGE确定,而DNA与RNA的分子质量可以由琼脂糖凝胶电泳来确定。对某一分子而言,其分子质量的对数与其Rf(相对迁移距离)存在线性关系。以标准物的迁移距离对其分子质量的对数作图,得到标准曲线,而样品的Rf 值一也就是分子质量一可以由图外推得到。
    1.制胶,胶的浓度应最适宜分离分子质量相近的分子。同时电泳分子质量标准物,其范围涵盖有目的分子的大致大小。
    2.跑胶,防止染料前沿跑出胶的边际。
    3.胶染色,拍照。如果样品是放射性标记的,你可以使用放射性标记的标准物或者把胶与放射自显影胶片相比较。4.测定从样品孔到每一标准条带的距离。计算每个数值的对数,画到常规图纸的Y 轴上。X 轴上是迁移的距离(以厘米计最方便)。对大多数标准物条带应该得到一条盲线。
    5.把样品迁移距离画到图上。外推标准曲线,确定分子质量。

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