2022年 8月 17日, 星期三
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抗体标记的步骤

下列步骤描述了使用Cy3作为代表性标记试剂, 用荧光succinimidy l 活性酶标记羊抗体。其他水溶性荧光标记物的使用与此类似(Mujumdar et al. 1993)

  • 抗体分离与纯化

来源于血清,腹水或培养基的抗体,在标记反应开始以前,需纯化以除去蛋白质和其他含有氨基团的分子。在与标记反应混合以前,抗体不应进行强缓冲处理,不然标记混合物会降低,所有原始及次级氨基的化合物,除抗体外应以除去。最常使用的是碳酸盐和硼酸盐缓冲液。

  • 染料-二某甲酰胺或DMSO (0.3 – 1.0mg活性酯/100ml}中的succinimidyl活件酯(如Cy3)贮存液制备

在干燥器中,这些溶液4℃可以贮存4天,活性酯在灭菌水中, 其pH为弱酸或中性时,可保存数小时,如果DMF不适于某些抗体的话, 染料水溶液可用于标记,如果增大反应萤光团的比例不利于整体平衡的话,可以测定PBS中适当稀释后的一份贮存液并使用染料的消光系数来确定贮存液中的萤光团浓度。

  • 在0. 1mol/L碳酸盐- 碳酸氢盐缓冲液中(pH9.4)室温15分钟完成抗体标记:在0.25 ~ 1ml缓冲液中溶解1mg样IgG(6.45nmol), 添加200nmol/L (约0.2mg)染料并不停旋转混合
  • 凝胶渗透通过层析(0.7cmX 20cm SephadexG -50柱),用pH7的PBS缓冲液作为冼脱液,将未结合的染料从标记蛋白质中分离出来。

注意事项

  • 除了靶分子外, 在缓冲液中不应存在有原始氨基成分是绝对必要的. 否则染料主要是与含有氨基的成分起反应, 而不是抗体, 例如Tris应避免使用
  • 标记应在暗光下进行,标记产物用锡箔包好, 防止见光
  • 如果反应中所使用的抗体量过少, 则从凝胶过滤柱中难以获得满意的标记产量,可以使用塑料枪头制作微型柱
  • 如果染料放置时间过久, 或长时间暴露于高湿环境下. 可能失去反应性: 通过在甲醇或乙醇中标记一个有机胺来检查反应活性,逆相TLC可证实所标记的胺的存在
  • 标记试剂与抗体分子结合时, 显示出明显的光谱变化. 这时需要更为精确地测定F/P值,例如, 当染料二聚体和单体具有不同的吸收峰和不同的消光系数, 此时需要这种方法:在这种情况下, 所标记的蛋白质溶解于甲酰胺以利于吸收光谱, 染料的消光系数单独测定用于计算。

 

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