2022年 1月 28日, 星期五
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如何将胶内物质转移到膜上?

凝胶是厚而易碎的基质,这使得操作与温浴都很困难。如果要对胶内的内容物进行杂交,必须将内容物从凝胶引导到硝酸纤维素膜或者尼龙膜上。这一过程称为转移。

转移之后,滤膜与一个探针温浴,观察探针是否能与滤膜上的分子杂交。探针由放射性元素或者其他指示剂标记,所以可以被检测。滤膜与探针的杂交称为印迹。

第一次使用印迹技术是由Southern 描述的, 因此, 这种印迹被称为Southern 印迹。

不同种类的模板与探针的使用有不同的名称。

Southern 印迹:滤膜上的DNA 由DNA 探测。

Northern 印迹:滤膜上的RNA 由DNA 或者RNA 探测。

Western 印迹:滤膜上的蛋白质由抗体探测。

Southwestern 印迹:滤膜上的DNA 由蛋白质探测。

Middle eastern 印迹: Poly (U) 来源的滤膜由mRNA 探测。

生物材料由凝胶转移到滤纸或膜上有三种方法:

毛细管转移:用千DNA 和RNA 。

真空转移:用于DNA 和RNA 。

电泳转移:用于DNA 、RNA 和蛋白质。主要有两种装置来做印迹,都是利用电流来驱动分子向阳极方向转移到膜上。分别是干式转膜仪或半干式转膜仪(电流是由浸在阳极与阴极转移缓冲液中的滤纸来携带的)和湿式转膜仪(其中凝胶与膜都浸在转移缓冲液中) 。电泳转移需要能输出高电流的电源装置。

*滤膜

  • 市售的膜有整卷的或大小预先裁剪好的两种。除非实验室每个人使用同样大小的凝胶,否则购买整卷的。
  • 裁剪或移动任何滤膜的时候要戴好手套。手指上的油脂会阻碍转移。
  • 用干净的平头摄子夹取滤膜。锋利或尖的摄子会戳坏滤膜。
  • 转移用膜的选择主要是尼龙(种类繁多)和硝酸纤维素膜(普通型或者易于操作的乙酸纤维索增强型) 。
  • 尼龙膜最适合核酸。耐用、与核酸结合能力强、膜上物质可以脱去而用于多次杂交。尼龙往往染色背景较深,因此杂交过程中需要高浓度的封闭液。阳离子化的尼龙膜最适宜核酸,因为与核酸的结合并不依赖于缓冲液的离子强度。核酸不能通过电泳转移到硝酸纤维素膜上。
  • 硝酸纤维素膜最适合某些蛋白质, 而尼龙膜最适合于另一些。尼龙通常有更强的结合能力,但是有些蛋白质根本不结合。如果不得不使用硝酸纤维素膜,使用增强型的硝酸纤维素膜。可以尝试一下PVDF ( 聚偏二征乙烯) 尼龙膜。硝酸纤维素膜和尼龙膜的实验方案很不一样。实际上,不同类型的尼龙有不同的实验方案。
  • 一般不需要担心孔的大小, 0.45μm 是标准。较小孔径的滤膜可以用于专门用途。

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