英格恩技术博客 专注转染等实验

细胞转染效率影响因素

         转染技术是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展,转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中,其应用越来越广泛。影响转染效率的因素有很多,细胞株本身的特性和活性,细胞培养条件,转染的DNA或RNA的质量,转染方法,转染试剂的选择等。

       常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β – 半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。
转染效率受多种因素影响,主要因素有下面几个:
1.转染试剂
不同细胞系转染效率通常不同,但细胞系的选择通常是根据实验的需要,因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献,通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然,最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂,如英格恩生物的Entranster试剂,纳米材料,超越脂质体,可达到较好的结果。

2.细胞状态
一般低的细胞代数(<50)能确保基因型不变。最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞,细胞生长旺盛,最容易转染。细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变,总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变化。也就是说同一种系的细胞株,在各实验室不同培养条件下,其生物学性状发生不同程度的改变,导致其转染特性也发生变化。因此,如果发现转染效率降低,可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。

3.转染方法
不同转染试剂有不同的转染方法,但大多大同小异。转染时应跟据具体转染试剂推荐的方法,但也要注意,因不同实验室培养的细胞性质不同,质粒定量差异,操作手法上的差异等,其转染效果可能不同,应根据实验室的具体条件来确定最佳转染条件。

4.载体构建
转染载体的构建(病毒载体,质粒DNA,RNA,PCR产物,寡核苷酸等)也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高,但不同病毒载体有其特定的宿主,有的还要求特定的细胞周期,如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞,此外还需考虑一些安全问题(如基因污染)。除载体构建外,载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响,如前面提到的超螺旋及线性DNA对瞬时和稳定转染的影响。如果基因产物对细胞有毒性作用,转染也很难进行,因此选择组成或可调控,强度合适的启动子也很重要,同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。

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