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WB内参的重要性

在Western Blot实验中,可能存在总蛋白浓度测定不准确;或者蛋白质样品在电泳前上样时产生的样品间的操作误差。所以一般的Western Blot实验都需要进行内参设置。

1内参即是内部参照(Internal Control),Western Blot实验中选择内参作为参照体系对于实验结果的分析具有很好的说明性。对于哺乳动物细胞表达来说,内参一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins),它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blot中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参,这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达,由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定,借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差,这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

在Western Blot 实验中,除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外,还需要进行内参的检测,以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。通过测定每个样品中实际转到膜上的内参的含量检验你的整套western装置是否正常运转,包括你的配液,你的胶以及电泳和转移,一抗的效价以及显色等. 内参的设置还可以检测你的样品蛋白含量是否相等,以便校正误差,具体校正的方法就是将每个样品测得的目的蛋白含量与本样品的内参含量相除,得到每个样品目的蛋白的相对含量。然后才进行样品与样品之间的比较。

严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系,常用的蛋白质内参有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin等,是一些细胞的基本结构蛋白或是管家蛋白,细胞表达稳定,且表达水平高,在同一种类的细胞上表达基本一致。

内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参! Western Blot实验中内参的选择及其使用方法都会直接影响对实验结果的分析。

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