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MTT法细胞增殖检测中需要注意的8大问题

MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活的方法。MTT,即四氮唑化合物,能与活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶发生反应而将淡黄色的MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶物甲瓒而沉积在目的细胞中。在一定的细胞数范围内,甲瓒的形成量与细胞数成线性关系。用DMSO将细胞中沉积的蓝紫色甲瓒溶解后,在多功能酶标仪上检测其相应的吸光值,计算细胞浓度。

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需注意的是,MTT只能与活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶发生反应而死细胞无此功能,故只适用于测定活细胞的细胞存活率。此外,MTT法只能检测细胞的相对数量和相对活力,而无法检测细胞的绝对的数量。用酶标仪检测细胞吸光值时,为了保证细胞浓度与吸光值之间的线性关系,吸光值最好控制都在0-0.7范围内。

普通MTT法实验步骤:

1:接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul.

2: 培养细胞:同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。

3:呈色:培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS制,pH=7.4)20ul.继续孵育4 h,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO,振荡10min,使结晶物充分融解。

4:比色:选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

药物MTT法实验步骤

贴壁细胞:
1: 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000- 10000 孔,(边缘孔用无菌PBS填充)。

2: 5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度的药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个,否则难以反应真实情况

3: 5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。

4: 每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4h。若药物与MTT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液。

5: 终止培养,小心吸去孔内培养液。

6: 每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

7: 同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)。

悬浮细胞:
1: 收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将①补足的无血清培养基40ul ;②加Actinomycin D(有毒性)10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20);③需检测物10ul;④细胞悬液50ul(即5×104cell/孔),共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加100ml 培养基)

2: 置37℃,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。

3: 每孔加入10 ul MTT溶液(5 mg/ml,即0.5%MTT),继续培养4 h。(悬浮细胞推荐使用WST-1,培养4 h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值)

4、离心(1000转x10min),小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm(630nm校准)测量各孔的吸光值。

5、同时设置调零孔(培养基、MTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜),每组设定3复孔。

注意事项

(1)培养好目的细胞
将目的细胞培养好是一切细胞实验的基础。如果不知道如何培养细胞,可查看相关的文献,不同细胞有各自的不同特点,可根据自己的实验要求及培养经验适当调整。培养细胞的过程中,注意无菌操作,切记引起细胞污染。

(2)细胞铺板
将细胞培养一段时间后,大概了解细胞的增殖情况。根据细胞的生长情况反推铺板时的细胞浓度。将消化后的细胞反复吹打,充分混匀尽量使细胞消化成单个细胞,计数再铺板。此时,注意不要过分依赖细胞计数,因为细胞计数时,取样量较多(10微升),存在细胞颗粒的不均匀分布会直接影响后期实验,故掌握细胞计数,但细胞铺板时不能完全依赖它。选择适当得细胞接种浓度。

(3) 避免血清干扰
一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

(4)设空白对照
与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,
最后比色以空白调零。

(5)加MTT
如果待检测药物有氧化还原性,则加MTT前换一次液或用PBS将细胞清洗一遍,防止待测药物将MTT还原成棕褐色沉淀,影响实验结果。注意,加入MTT溶液时,在避光条件下进行。

(6)加DMSO溶液
加入MTT避光培养4h后,弃去各孔中的液体并加入500微升的DMSO(24孔板)。为了将沉淀完全溶解,加入DMSO后在摇床上震摇10min。提醒:如果目的细胞贴壁不牢固,弃去液体时容易丢失部分细胞沉淀,因此贴壁不好的细胞在铺板前预处理(用多聚赖氨酸处理),或在弃液前用离心机离心,收集部分细胞沉淀。

(7) 一般每孔细胞浓度在20000个/ml为宜,MTT加20ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加150ul DMSO,在脱色摇床上振荡10分钟,然后测吸光值。

(8)MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系。

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