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ELISA不得不懂的实验原理

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。

在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。

由于酶的催化频率很高,故可极大地地放大反应效果,从而使测定方法达到很高的敏感度类型及步骤

ELISA的主要常用类型及步骤

1. 间接法测抗体

间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体(二抗)以检测与固相抗原结合的受检抗体,故称为间接法。操作步骤如下:

1)将特异性抗原与固相载体联结,形成固相抗原,洗涤除去未结合的抗原及杂质。

2)加稀释的样本,保温反应。样本中的特异抗体与固相抗原结合,形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后,固相载体上只留下特异性抗体,样本中的其他成份在洗涤过程中被洗去。

3)加酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗抗体结合,从而间接地标记上酶。洗涤后,固相载体上的酶量与样本中受检抗体的量正相关。

4)加底物显色。

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2. 双抗体夹心法测抗原

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下:

1)将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。

2)加受检样本,保温反应。样本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。

3)加酶标抗体,保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与样本中受检抗原的量相关。

4)加底物显色。

 

3. 双抗原夹心法测抗体

反应原理和模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体

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4.竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点,因此不能用双抗体夹心法进行测定,可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多,结合在固相上的酶标抗原愈少,最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

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