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细胞冻存的7个注意事项

一、细胞冻存

方法:

冻存液最好现配:按1:3:6(或1:2:7) 配冻存液1份DMSO3份血清和6份培养基(养细胞时用什么培养基冻存时就用什么培养基)。取生长状态量好的细胞进行冻存处理,

对于贴壁细胞:
1 吸出旧培养液加PBS冲洗一次
2胰酶消化
3加培养基中止消化,有的细胞是加血清中止
4离心收集细胞,不同细胞离心率不一样(以上仅为贴壁细胞,悬浮细胞收集就用第四部)
5吸出离心管上清液,加1ML 的冻存液重悬细胞,移到冻存管,放4度半小时,-20 度两小时,-70度过夜,再放液氮长期保存

悬浮细胞:直接离心收集,PBS洗涤

dongcun

注意事项:

  1. 错误的时机:

细胞状态不好(长的太过了,培养液已经很黄;细胞可疑污染;细胞已 经开始凋亡或崩解;连续培养超过二个月,细胞性状已有改变改变)。

 

解决:

最佳时机:细胞增殖旺盛,情况稳定,试验效果良好,复苏后两周内。

 

  1. 细胞太少:

冻存时细胞浓度低于1-5×1000,000/ml。(复苏很难成功)。

 

解决:

离心后调整细胞浓度。(不要重新洗细胞)。

 

  1. 盖子不紧:

冻存管的盖子一定要拧紧,否则复苏水浴时会渗水,造成污染。

 

解决:

选择原配的管子和盖子(不同牌子/型号的颜色会有差别)。

 

  1. 单薄的冻存盒:

放在-80度的冻存盒,壁太薄,细胞在被迅速降温。

 

解决:

选择厚壁泡沫塑料盒,或塞入大量干棉花。(冻存的原则:缓降!)

 

  1. -80度太久:

放在-80度冰箱的时间超过半年。(冰箱的温度难以恒定:开门/关门,电压不稳等)

 

解决:

尽快转入液氮。

 

  1. 液氮不足:

液面不能漫过所有细胞。

 

解决:

定期测量液氮储备,保证细胞全部浸在液面下。

 

  1. 取错细胞:

找不到/拿错冻存管。

 

解决:

每支冻存管都标上细胞的名称,冻存时间,并记录在册。

 

二、细胞复苏:

 

方法:

  1. 从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化。
  2. 从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上培养液,混匀;
  3. 离心, 1000rpm,5min;
  4. 弃去上清液,加入含10%小牛血清培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种培养瓶,37℃培养箱静置培养;
  5. 次日更换一次培养液,继续培养。

 

注意事项:

  1. 取错细胞:

拿错冻存管。(快快快,匆忙之中,难免出错,况且-170多度,冻手!)

 

解决:

(1)核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。

(2)拿细胞时戴手套!

 

  1. 水浴时间太长:

2min还没融化。(冻存管的壁较厚,隔热)

 

解决:

(1)适当提高水浴温度(37度-40度)。

(2)要是冬天,就选用保温盒。

 

  1. 冰盒内时间太长:

复苏1h后,还没有加入新的培养液。(高浓度DMSO防止胞内形成冰晶,冻存时保护细胞,但复苏融解后,浸泡时间太久会,对细胞有毒性)

 

解决: 提前预定超净台,减少复苏后插在冰盒里等待的时间。

 

  1. 失去耐心:

复苏三四天后,细胞没有任何动静,认为失败,倒掉所有细胞。(有些细胞复苏后一星期,才有起色)

 

解决: 不要换液,耐心等待,两周后再做决定。

 

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