英格恩技术博客 专注转染等实验
主页 / ECL发光实验 / 封闭问题可大可小,千万不能掉以轻心

封闭问题可大可小,千万不能掉以轻心

Western Blot是检测一个基因的表达产物是否正确,或者比较表达产物量的相对变化的首选方法,也是实验室常见的实验方法。图片1

完整的Western实验过程比较长,做一次Western也不容易。有结果当然是好的,没有结果也是常有的事,出现各种烦心结果也是时有发生。其中最常见的一种就数显色后背景高了。背景高,目的蛋白颜色对比不明显,要么看不清,图片展示不理想,更别说进行数据分析了。

Western显色背景高的原因有很多:封闭的问题,洗脱问题,一抗二抗问题,等。其中最显著的就是封闭问题。

Western 实验中,PVDF膜在甲醇活化后是带电的,因而在转膜时将蛋白吸附。封闭的目的是就将PVDF膜上无蛋白的部分空隙填满,以免孵抗体的时候,一抗二抗与之结合,产生非特异条带或者是背景杂乱。封闭这一步还是比较关键的,封闭不好容易造成高背景。最常用的封闭也就是脱脂奶粉和BSA。

封闭条件根据自己的实验选择,一般为5%脱脂奶粉或1~3%BAS室温封闭2-4h,但最好4度过夜。判断封闭条件,要考虑在此条件下是否能达到实验要求。从成本上来说,脱脂奶粉是首选,脱脂奶粉封闭的背景较低,又很经济,大部分实验都可以选用脱脂奶粉,但应该选用质量好的奶粉,但是选择的时候也不是随便那款奶粉都是适用来做实验的。一般进口奶粉会好点,主要是比较细腻,溶解起来方便点。一般来说脱脂奶粉对于多数抗体来说效果不错,但二抗与牛奶可能有交叉反应,因此洗涤很重要。

另外BSA蛋白单一,可降低因牛奶其他成分引起的背景。因为奶粉含有酪蛋白(一种磷蛋白),如果用奶粉,有可能出现背景深的现象。 这就取决于抗体的质量了。还有也的看你是做什么体系的,如果是生物素和亲和素体系的,可能最好选用BSA了,因为奶粉中也含有生物素的,可能会干扰试验结果。另外选择BSA时,如果一抗来源的和封闭血清来源种属太接近,也会出现背景高的情况,这时就不能用BSA、种属太接近动物血清封闭。做磷酸化蛋白时,理论上来讲,最好用BSA可以降低背景,建议:先用脱脂奶粉,如果背景脏,就改为BSA。

封闭液的浓度也可以提前优化,过低或过高都会造成不好的影响。过低封闭浓度势必造成本底过高,但过高又会使灵敏度降低,因此只要选择能够满足你试验要求的最低浓度就可以了。另外提醒,洗涤一定要彻底,很重要的。

封闭是为了阻止PVDF膜与一抗的非特异性结合,避免杂带的出现或背景杂乱。在封闭过程中必然会损失血清蛋白,封闭液可以回收利用,-20度保存,但重复用多次后效果必然变差。封闭这一步还是比较关键的,封闭不好容易造成高背景,用量及封闭液体积在正常用量范围问题都不大,封闭的时间也可以适当延长。

关于Western封闭今天就先说道这里,有任何疑问或问题可以随时跟博主交流,欢迎大家多多评论提意见~~~

扫描二维码,随时阅读沟通。

英格恩技术的微信

Check Also

WB内参的重要性

在Western Blot实验 …

发表评论

电子邮件地址不会被公开。 必填项已用*标注

*