英格恩技术博客 专注转染等实验

如何对包涵体蛋白进行表达与复性

涵体即在某些生长条件下,在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适,无法形成正确的次级键等原因形成的。表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快,以至于没有足够的时间进行折叠,二硫键不能正确的配对,过多的蛋白间的非特异性结合,蛋白质无法达到足够的溶解度等。

3

关于包涵体的复性一直是生物制药的瓶颈,包涵体的处理一般包括这么几步:菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化。

一、包涵体蛋白的表达
在平板上挑取单菌落,接种于含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的5 ml LB培养基中,37 ℃过夜培养,然后转接到100 ml LB 培养基中,37 ℃培养至A600 为0.4~0.6时,加入IPTG 至终浓度为0.5

mmol/L 诱导3.5 h。8000 r/min 离心5 min 收集菌体,加入10 ml 50 mmol/LTris-HCl,冰浴下超声波破碎后12000 r/min离心30 min收集沉淀。

二、包涵体的洗涤
在包涵体中加入包涵体洗涤液:50 mmol/L Tris—HCl,1 mmol/L EDTA,50 mmol/LNaCl,w=0.5%TritonX-100,pH 8.0;,37℃振荡洗涤1~2 h,然后8 000 r/min 离心15 min,收集沉淀。

三、包涵体的溶解
洗涤后的包涵体加入适量的(包涵体溶解液):6 mol/L 尿素,50 mmol/L Tris—HCl,1 mmol/L EDTA,50mmol/L NaCl,10 mmol/L β-ME,pH 8.0(注:β-ME用时现加),于磁力搅拌器上搅拌过夜,1000 r/min离心30 min,取上清即得包涵体溶解液。

四、包涵体的复性
包涵体的复性目前常用的主要有两种方式:1,稀释溶液,但是操作的液体量大,蛋白稀释;2,透析,超滤或电渗透析去除变性剂。

1.包涵体的稀释复性
设定不同的复性条件:蛋白质量浓度、尿素浓度、温度、氧化还原条件、加入Ttiton X-100与环糊精的量、复性时间等,使变性溶解的包涵体稀释复性,复性一定时间后取样测酶活性。

2.包涵体的透析复性
包涵体蛋白的复性将8 mol/L 尿素溶解后的样品装入透析袋,密封置于复性液I(0.2 mol/L Tris-HCl;0.5 mol/L NaCl;5%甘油;5 μmol/L EDTA;pH8.5),4 ℃
透析12 h 后再转入复性液II(0.2 mol/L Tris-HCl;0.5 mol/L NaCl;)4 ℃ 透析12 h,12000 r/min 离心30 min,收集上清进行蛋白浓度及活性测定。

复性前对蛋白的性质一定要清楚
1. 蛋白预期的二级结构都是些什么。一般来说beta sheet占多数的蛋白较易复性1
2. 蛋白pI
3. 氨基酸组成,比如有没有cystine
4. 有没有底物?如果有结合的ligand之类,通常加入后会有所帮助,
5. 一般尿素中含有非常高的一种杂质(暂时记不起什么名字了,如果楼主一定要请回帖我再找找),当达到8 M的时候杂质的浓度也很大了。有的实验室会先纯化一下尿素,然后再溶解,有的直接先试GuHCl
6. 复性一般是梯度稀释,或者梯度透析,或者在柱上缓慢降低Urea,一下子降低太快(你的复性液)可能也是原因之一。
7. 盐浓度是否可以再高些?一般可以达到0.5 M,如果有更好的盐(如果这个蛋白的生化性质比较了解的话,应该再加入一些别的盐)
8. 一般会有Glycerol
9. 一般会有Arginine或者glycine

虽然复性成功的例子很多,但是还是建议首先尝试更换载体:pet32a、PGEX、Pmal都有可能促进蛋白可溶,由包涵体表达变成可溶表达。毕竟复性的条件很难摸索,成功的概率太小,浪费的时间也太多。

扫描二维码,随时阅读沟通。

英格恩技术的微信

Check Also

导致western Blot发光(ECL)“背景高”的原因有哪些?

Western Blot发光经 …

发表评论

电子邮件地址不会被公开。 必填项已用*标注

*