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如何在原核细胞中表达外源基因?

基因重组是由于不同DNA链的断裂和连接而产生DNA片段的交换和重新组合,形成新DNA分子的过程。基因重组的目的是使目的基因的某一细胞中能得到高效表达,即产生人们说需要的高产目的的基因产物,如蛋白质、多肽内生物药物。

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基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA,经加工后在核糖体的协助下有转译出相应的基因产物——蛋白质,再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。从基因到功能的产物这整个转录、转译及所有的加工就是基因表达的过程,它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。

目前关于蛋白表达的体系可分为原核表达体系和真核表达体系两大类。总体上来说,原核表达体系和真核表达体系各有利弊。原核表达体系由于宿主一般为大肠杆菌等原核生物,因此和真核表达体系相比,原核表达体系的构建和诱导表达相对简单,同时目的蛋白表达量占总蛋白含量的百分比一般较真核表达体系多。但是原核表达体系由于不含有真核表达的翻译后修饰,所以在表达真核蛋白时,可能会导致表达的蛋白不能正确折叠而使表达的蛋白活性降低甚至没有活性。同时原核诱导表达蛋白的速率较真核表达蛋白的速率快,加之原核表达环境缺少真核的翻译后修饰,这很容易形成包涵体,但是这种形成一定程度上可以通过优化诱导条件或者更换促溶标签来降低包涵体比例。

 

大肠杆菌结构简单,遗传背景清楚,基因表达调控机制明确,外源蛋白可在大肠杆菌中获得高表达,便于大量生产具有生产或研究价值的天然蛋白,是研究外源基因结构/功能/表达调控合适宿主。大肠杆菌与其它宿主细胞不同,有其独特表达外源基因的机制,且基因表达是顺式DNA序列与反式蛋白调控因子相互作用的结果,基因表达水平既决定于合理设计DNA表达元件,也决定于宿主细胞种类。基因表达种类可分为组成型和诱导型两类。外源基因高表达,尤其表达产物对细胞有毒性时应采用诱导表达。

基因转录机制

基因的起始转录是基因表达的关键步骤。转录起始的速率是基因表达的关键步骤。选择可调控的启动子和相关的调控序列是构建一个表达系统首先要考虑的问题。

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外源基因起始站转录后,保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因优质表达的关键。一方面,要防止因转录提前终止的现象,另一方面,又要存在正常的转录终止序列一方盒子产生不必要的转录产物,是mRNA的长度限制在一定的范围内,从而增加外源基因表达的稳定性。核糖体在 mRNA 上结合或移动情况影响 P因子依赖、转录终止的效率。核糖体的翻译和停顿对转录减弱也起很大作用。基因间spacer不同,具体表达机制也所不同,对外源基因表达有影响。spacer长,两个基因翻译起始相互独立。spacer序列长度相当于正常SD序列到起始密码子距离,并具有SD序列特性,小亚基不离开mRNA,大亚基暂时离开。前一基因终止密码子与后一基因起始密码子部分重叠,核糖体两个亚基都不离开mRNA。在多顺反子mRNA中,各基因表达产物数量不等,如乳糖操纵子,半乳糖苷酶;半乳糖苷透性酶;半乳糖苷乙酰化酶大约为1: 0.5: 0.2

 

原核细胞表达外源基因的基本条件

1、原核表达载体:提供转录、翻译所必须的调控元件,如启动子、转录终止子、核糖体结合位点等。

(1)理想原核表达载体具备的基本特征:
A、具有能自主复制的复制子,松弛型,质粒高拷贝数,便于质粒大量制备及表达。
B、强启动子、强转录终止子,便于高水平转录,防止转录通读。
C、可诱导性,尤其在高表达对细胞有毒性的蛋白。
D、合适的核糖体结合位点,提高翻译起始效率和翻译水平。
E、具有多个单一酶切位点的多克隆位点,且酶切位点最好位于被检测的表型基因上,便于外源基因插入及筛选。
F、分子量小,便于较大外源基因的插入。
G、具有抗药性标志,有利于插入外源基因克隆的筛选。
H、安全,不污染环境,对人无害。

(2) 常用启动子:原核生物启动子分为诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子包括lac、trp、λPR、λPL、tac等启动子,组成型启动子包括T7噬菌体的启动子等。

启动子

诱导方式

诱导剂

lac

化学诱导

IPTG

trp

化学诱导

b吲哆丙烯酸或吲哆-3-乙酸

λPR

温度诱导

温度

λPL

温度诱导

温度

tac

化学诱导

b吲哆丙烯酸或吲哆-3-乙酸

2、外源基因:一定不含内含子

外源基因在大肠杆菌的表达

从表达产物可溶性分为可溶性表达和包涵体表达。在大肠杆菌中,当外源蛋白高水平表达的时候,极易形成包涵体。

(一) 包涵体产生原因
1、重组蛋白本身特性 2、二硫键形成的氧化还原环境不佳 3、重组蛋白过渡表达
4、宿主菌缺失蛋白折叠和运输所需的一些酶和辅助因子
5、重组蛋白表达处周围的化学条件不合适 6、宿主菌生长状态

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(二)增加可溶性表达的方法
1、融合表达(硫氧还蛋白融合表达)。 2、分泌表达:合适启动子-信号肽。
3、外源基因和折叠酶基因或分子伴侣基因共表达或融合表达。(DsbA,
4、表达产物随机突变或定点突变(如转角氨基酸点突变)。5、改变生长条件:如降低培养温度,改变PH。6、选择不同的宿主菌(硫氧还蛋白还原酶缺陷株)

原核表达存在问题

1. 表达产物翻译后不能有效地修饰和加工。
2. 包涵体形成:
表达产物需变性、复性,恢复生物活性,有可能造成二硫键错配,表达产物构型不均一性,活性降低或丧失。
3. 表达产物N端可能含有甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸。

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